表达载体及其高效表达和制备人胱抑素C蛋白的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达载体及其高效表达和制备人胱抑素C蛋白的方法。

背景技术：

胱抑素C(CysC)又称半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂。CysC被广泛用于糖尿病、儿科疾病、肾移植以及脊髓损伤患者的肾功能的监测。此外，它在脑血管疾病、心脏疾病、肿瘤以及肝纤维化等方面也也体现了较为广阔的应用前景。在早期诊断肾脏损伤方面，CysC具有较高的敏感性，是迄今为止基本能够满足肾小球滤过率(GFR)理想内源性标志物要求的物质，因而，联合其他诊断指标对肾脏疾病的早期诊断有重要临床意义。但是由于某些技术上的缺乏，导致目前国内市场上采用的CysC诊断试剂及标准品主要由国外公司提供，价格昂贵，使病人和社会医疗成本较高，目前临床应用较少。

目前已公开了一些人胱抑素C蛋白的制备方法，但多是利用原核表达系统表达，缺乏人胱抑素C蛋白后加工与修饰。此外，利用真核表达系统制备的蛋白收率又比较低，约3mg/L,成本较高，不利于大规模的生产及应用。

技术实现要素：

因此，本发明的目的是提供一种表达载体及其高效表达和制备天然人胱抑素C蛋白的方法，从而可以使人胱抑素C蛋白的产量提高7-8倍，并且方法简单，成本低。

一方面，本发明提供一种重组人胱抑素C表达载体，包括哺乳动物表达载体和CD33蛋白信号肽的编码基因，所述CD33蛋白信号肽的编码基因的序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

优选地，所述哺乳动物表达载体为pcDNA^TM3.3-TOPO、PTT5或pcDNA4/His A。

优选地，所述CD33蛋白信号肽的序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

优选地，所述表达载体中还包括Kozac序列，所述Kozac序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，该Kozac序列的引入能够增强真核基因翻译效率。

另一方面，本发明还提供一种新表达载体pcDNA^TM3.3-TOPO-CD33，包括上述重组人胱抑素C表达载体。

优选地，所述细胞为HEK293细胞、NSO细胞或CHO细胞。

还一方面，本发明还提供一种重组人胱抑素C表达载体在用于制备重组人胱抑素C蛋白中的应用。

又一方面，本发明还提供一种细胞在用于制备重组人胱抑素C蛋白中的应用。

再一方面，本发明还提供一种重组人胱抑素C蛋白的制备方法，包括以下步骤:

1)将CD33蛋白信号肽的编码基因插入哺乳动物表达载体中，得到重组人胱抑素C表达载体，所述CD33蛋白信号肽的编码基因如SEQ ID NO:1所示；

3)再将所述重组质粒在细胞中进行表达，纯化，得到重组人胱抑素C蛋白。

优选地，在步骤1)中，所述CD33蛋白信号肽的编码基因通过按照人胱抑素C基因成熟肽的序列设计引物克隆获得，上游引物的基因序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的基因序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明的利用哺乳细胞表达载体，通过对引导人胱抑素C蛋白分泌表达信号肽的优化，采用了CD33蛋白的信号肽，使得重组人胱抑素C蛋白在HEK293细胞中的表达达到了23mg/L的表达量，比现有技术中的普通方法提高了7-8倍，克服原核表达系统无法完成翻译后加工与修饰的缺点的基础上，利用哺乳表达系统获得了高产量的重组人胱抑素C蛋白；通过镍柱一步纯化，经SDS-PAGE分析获得了纯度>95％的重组人胱抑素C蛋白，经Sec-HPLC分析，纯度达到99.9％以上。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为哺乳细胞表达载体pcDNA^TM3.3-TOPO质粒图谱。

图2为本发明中的纯化后重组人胱抑素C蛋白的SDS-PAGE还原和非还原电泳图，其中R表示还原状态下的电泳结果，NR表示非还原状态下的电泳结果，MK表示蛋白marker。

图3为本发明中的重组人胱抑素C蛋白的Sec-HPLC色谱图。

具体实施方式

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂和药品均可从正规渠道商购获得。

实施例1人胱抑素C蛋白的信号肽优化

CD33蛋白具有高分泌天然信号肽序列，本方法采用在线信号肽预测网站SignalP 4.1Server http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/对以CD33蛋白信号肽替换人胱抑素C自身信号肽对人胱抑素C成熟肽的分泌的信号肽切割位点进行预测，结果显示切割位点位于CD33信号肽的丙氨酸16和甲硫氨酸17之间，说明CD33蛋白信号肽可以引导人胱抑素C成熟肽的分泌。

实施例2人胱抑素C哺乳表达载体的构建，表达及纯化

1.人胱抑素C哺乳表达载体的改造

哺乳表达载体pcDNA^TM3.3-TOPO(Invitrogen)经改造在TOPO克隆位点处引入Kozac序列(SEQ ID NO:5：GCCGCCACC，用来增强真核基因翻译效率)及CD33蛋白信号肽(核苷酸序列:SEQ ID NO：1；氨基酸序列：SEQ ID NO：2)，同时在信号肽之后引入Xho I和EcoR I酶切位点，以便基因的插入，改造后的载体命名为pcDNA^TM3.3-TOPO-CD33，pcDNA^TM3.3-TOPO-CD33载体质粒以Xho I和EcoR I双酶切对载体线性化处理，胶回收。

2.人胱抑素C哺乳表达载体的构建

按照pcDNA^TM3.3-TOPO-CD33载体及人胱抑素C基因成熟肽的序列设计引物：

上游引物：

GTGGGCAGGGGCCCTGGCTATGTCCAGTCCCGGCAAGCCGCCG(SEQ ID NO:3)

下游引物：

CATTACTAACCGGTGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGGCGTCCTGACAGGTGGA(SEQ ID NO:4)。

以带有载体同源序列(下划线部分)的上下游引物在55℃退火条件下扩增人胱抑素C编码成熟肽基因片段(79-438bp)，胶回收，使用NovRec seamless cloning试剂盒无缝连接到pcDNA^TM3.3-TOPO-CD33经双酶切线性化处理后的载体上。转化DH5a,利用菌落PCR进行阳性鉴定，将鉴定为阳性的重组子进行测序鉴定。将测序正确的克隆安排质粒中抽，用于HEK293细胞的转染。

3.人胱抑素C在HEK293细胞(购自罗氏公司)中的表达

3.1.转染前1天传代密度为0.6×10⁶个/ml或前2天传代密度为0.3×10⁶个/ml；

3.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1-1.4×10⁶个/ml，活力>80％时，用于转染；

3.3.转染复合物配制：每个项目需备两个/离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置：

管中加入600μl PBS/培养基，20μg质粒，混匀，静置5min；

管中加入600μl PBS/培养基，80μg聚醚酰亚胺(PEI)(PEI/质粒＝4：

1)，混匀，静置5min；

3.4.将稀释后的PEI加入至稀释后的质粒中，快速颠倒6-10次，混合均匀，配制成转染复合物(转染复合物配制时动作一定要轻柔迅速，混合均匀，以防止局部DNA-PEI复合物的产生)；

3.5.转染复合物静置15-20min后，单滴匀速加入细胞培养物中(边滴加边摇晃细胞培养物)；

3.6.于37，8％CO₂，130rpm，摇床培养，5天后进行产物收集检测。

4.重组人胱抑素C蛋白的纯化

4.1样品预处理

20ml培养上清加入20mM PB,200mM NaCl调节pH至7.5。

4.2亲和纯化

柱子(Column)：Chelating SFF(柱体积0.3ml)

缓冲液A(Buffer A)：20mM PB,150mM NaCl,pH7.5

缓冲液B(Buffer B)：20mM PB,150mM NaCl,500mM Imizadole,pH7.5

纯化过程：用Buffer A平衡缓冲液处理。上样，收集流出液。上样完毕，再用Buffer A平衡柱子至少10ml。平衡后用含有50mM、500mM的咪唑缓冲液洗脱，并分别收集洗脱液。每个梯度分开收集0.3ml，0.9ml，0.7ml。收集的蛋白经SDS-PAGE分析，SDS-PAGE分析还原和非还原条件下电泳图，结果如图2所示，所得蛋白大小为14kd左右，与理论大小一致，并且经蛋白经凝胶成像仪扫描显示条带单一，纯度较高(图2)；此外，将制得的蛋白经Sec-HPLC(岛津LC_20AT)检测(通过检测器(SPD_20A)，检测波长为280nm，色谱柱为MAbPac SEC-1，以20mM磷酸缓冲溶液，150mM氯化钠，PH7.4作为流动相，流速为0.2mL/min，分析纯度达95％以上(图3)，表明通过该方法纯化得到了人胱抑素C蛋白，并且纯度高。

并且，依据A280(nm)紫外光吸收法测定蛋白浓度计算得到重组人胱抑素C蛋白在HEK293细胞中表达纯化所得收率为23mg/L，比现有技术中的普通方法提高了7-8倍，提高了表达产量，并且纯化工艺简单，成本低，收率高，蛋白纯度高。

实施例3

将实施例2中测序正确的中抽质粒，按照实施例2中提到转染HEK293细胞的方法转染CHO细胞(罗氏)，进行表达小试，按实施例2中提到的纯化方法对CHO细胞分泌液进行重组人胱抑素C蛋白的纯化。结果表明，经A280(nm)检测计算得，重组人胱抑素C蛋白在CHO细胞表达可到达15mg/L。

实施例4

以PTT5为表达载体,无缝克隆将CD33蛋白信号肽和人胱抑素C蛋白成熟肽基因及C-6His连接至PTT5表达载体(由Yves Durocher实验室馈赠)。同样地，将克隆正确的中抽质粒按实施例2提到的转染方法进行转染HEK293细胞(罗氏)，按实施例2提到的纯化方法对细胞分泌液进行蛋白提纯，结果表明，重组人胱抑素C蛋白表达量约为18mg/L。以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。