本发明涉及一种副猪嗜血杆菌高密度培养方法，属于微生物培养技术领域。
背景技术：
副猪嗜血杆菌属于革兰氏阴性短小杆菌，形态多变，有15个以上血清型，其中血清型4、5、13最为常见（占70%以上）。该菌生长时严格需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子），不需要X因子（血红素或其它卟啉类物质），在血液培养基和巧克力培养基上生长，菌落小而透明，在血液培养基上无溶血现象。副猪嗜血杆菌感染引起的猪的副猪嗜血杆菌病，主要表现为多发性浆膜炎、多发性关节炎、肺炎、胸膜炎、心包炎、脑炎，病猪死亡率较高。
然而，副猪嗜血杆菌的高密度培养非常困难，例如对营养需求高，尤其是对pH要求严格。现有技术中，常用的培养基为TSB培养基，但是并不能满足大规模的培养。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了一种副猪嗜血杆菌高密度培养方法，通过本发明可以实现副猪嗜血杆菌高密度的培养。本发明技术方案如下：
一种副猪嗜血杆菌高密度培养方法，具体步骤如下：
（1）斜面培养：将菌株副猪嗜血杆菌血清4型接种到0.1%NAD的TSA培养基上进行培养，培养温度为37℃，体积分数为3%的CO2恒温培养箱中培养30h；
0.1%NAD的TSA培养基：酪蛋白胰酶消化物 15g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物 5g，氯化钠 5g，NAD 1g，琼脂15g，加纯净水至 1L，调 pH 使得灭菌后为7.3，灭菌温度115℃，灭菌时间15min。
（2）种子扩大培养：从步骤（1）的TSA培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，将菌体溶液接种到0.1%NAD的TSB培养基上进行扩大培养，接种量为 4%（v/v），扩大培养的温度为 37℃，摇床转速 120r/min，培养时间为12h。
0.1%NAD的TSB培养基：酪蛋白胰酶消化物 15g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物 5g，氯化钠 5g，NAD 1g，加纯净水至 1L，调 pH 使得灭菌后为7.3，灭菌温度115℃，灭菌时间15min。
（3）发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为4%（v/v），扩大培养温度37℃，摇床转速150r/min，发酵周期36h。
发酵培养基：酵母膏30g，氯化钠8g，胰蛋白胨5g，硫酸钾0.05g，磷酸二氢钠1g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物10g，谷氨酰胺4g，NAD 1g ，用自来水配成 1L 溶液，调 pH 至灭菌后为 7.2，灭菌温度 121℃，灭菌时间 15min。
（4）30L 发酵罐培养：将步骤（3）中发酵培养后的发酵液接种到 30L
发酵罐的发酵培养基中，发酵培养基为10L，接种量为4%（v/v），控制罐压强为0.05MPa，在37℃条件下培养 48 小时，搅拌转速为400rpm，通入CO2，使得CO2占气体总体积的比例为3%，发酵培养后即得高密度副猪嗜血杆菌发酵液。
本发明中，发酵装置包括发酵罐、搅拌器、加热装置、发酵培养基物料箱、酸试剂箱、碱试剂箱和中央处理器，发酵罐的底部设有搅拌器，搅拌器上设有pH检测装置，pH检测装置与发酵罐顶部的pH显示器通过导线连接，pH显示器通过导线与中央处理器连接，中央处理器通过导线分别与发酵培养基物料箱、酸试剂箱和碱试剂箱，发酵培养基物料箱、酸试剂箱和碱试剂箱分别通过导管与发酵罐连接，发酵培养基物料箱与发酵罐之间的导管上设有开关，发酵罐底部设有出料口，出料口上设有电磁阀B，电磁阀B与央处理器无线连接，发酵罐顶部近边缘处设有CO2进气口和带有阀门的出气口，加热装置设置于发酵罐侧壁的外部。
本发明中，当pH检测装置将检测到的pH在pH显示器中显示出，pH显示器将信号传输给中央处理器，当pH不适合发酵时，中央处理器将信号传输给酸试剂箱或碱试剂箱，通过向发酵罐中加入酸或者碱，调节pH。
在上述技术方案的基础上，所述搅拌器为“Y”型；搅拌器上设有两个pH检测装置，这一结构有利于发酵培养基搅拌均匀，且检测到的pH更加准确。
在上述技术方案的基础上，加热装置为电加热装置；优选为盘管式电加热装置。
在上述技术方案的基础上，所述开关为电磁阀A；电磁阀A与中央处理器无线连接；优选的，电磁阀A和电磁阀B与中央处理器通过WiFi无线连接。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明培养过程中，为副猪嗜血杆菌提供了充分的营养成分，更重要的是，本发明可以随时调节发酵罐中的pH，通过本发明培养方法可以实现副猪嗜血杆菌高密度且连续的培养。
附图说明
图1为本发明发酵罐结构示意图。
符号说明：
1.发酵罐、2.搅拌器、3.加热装置、4.发酵培养基物料箱、5.酸试剂箱、6.碱试剂箱、7.中央处理器、8.pH检测装置、9.pH显示器、10.开关、11.出料口、12.电磁阀B、13.CO2进气口、14.带有阀门的出气口。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 一种副猪嗜血杆菌高密度培养方法
具体步骤如下：
（1）斜面培养：将菌株副猪嗜血杆菌血清4型接种到0.1%NAD的TSA培养基上进行培养，培养温度为37℃，体积分数为3%的CO2恒温培养箱中培养30h；
0.1%NAD的TSA培养基：酪蛋白胰酶消化物 15g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物 5g，氯化钠 5g，NAD 1g，琼脂15g，加纯净水至 1L，调 pH 使得灭菌后为7.3，灭菌温度115℃，灭菌时间15min。
（2）种子扩大培养：从步骤（1）的TSA培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，将菌体溶液接种到0.1%NAD的TSB培养基上进行扩大培养，接种量为 4%（v/v），扩大培养的温度为 37℃，摇床转速 120r/min，培养时间为12h。
0.1%NAD的TSB培养基：酪蛋白胰酶消化物 15g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物 5g，氯化钠 5g，NAD 1g，加纯净水至 1L，调 pH 使得灭菌后为7.3，灭菌温度115℃，灭菌时间15min。
（3）发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为4%（v/v），扩大培养温度37℃，摇床转速150r/min，发酵周期36h。
发酵培养基：酵母膏30g，氯化钠8g，胰蛋白胨5g，硫酸钾0.05g，磷酸二氢钠1g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物10g，谷氨酰胺4g，NAD 1g ，用自来水配成 1L 溶液，调 pH 至灭菌后为 7.2，灭菌温度 121℃，灭菌时间 15min。
（4）30L 发酵罐培养：将步骤（3）中发酵培养后的发酵液接种到 30L
发酵罐的发酵培养基中，发酵培养基为10L，接种量为4%（v/v），控制罐压强为0.05MPa，在37℃条件下培养 48 小时，搅拌转速为400rpm，通入CO2，使得CO2占气体总体积的比例为3%，发酵培养后即得高密度副猪嗜血杆菌发酵液；
实施例2 本发明中专用发酵罐的结构
如图1所示，发酵装置包括发酵罐1、搅拌器2、加热装置3、发酵培养基物料箱4、酸试剂箱5、碱试剂箱6和中央处理器7，发酵罐1的底部设有搅拌器2，搅拌器2上设有pH检测装置8，pH检测装置8与发酵罐1顶部的pH显示器9通过导线连接，pH显示器9通过导线与中央处理器7连接，中央处理器7通过导线分别与发酵培养基物料箱4、酸试剂箱5和碱试剂箱6，发酵培养基物料箱4、酸试剂箱5和碱试剂箱6分别通过导管与发酵罐1连接，发酵培养基物料箱4与发酵罐1之间的导管上设有开关10，发酵罐1底部设有出料口11，出料口11上设有电磁阀B 12，电磁阀B 12与央处理器7无线连接，发酵罐1顶部近边缘处设有CO2进气口13和带有阀门的出气口14，加热装置3设置于发酵罐1侧壁的外部。
实施例3
在实施例2的基础上，如图1所示，所述搅拌器2为“Y”型，搅拌器2上设有两个pH检测装置8，这一结构有利于发酵培养基搅拌均匀，且检测到的pH更加准确，加热装置3为盘管式电加热装置，开关10为电磁阀A，磁阀A和电磁阀B 12与中央处理器7通过WiFi无线连接。