一株从人体肠道中分离的能产生抗癌活性代谢产物的放线菌BI87及其用途的制作方法

本发明涉及一株放线菌，特别涉及一株从人体肠道中分离到具有可以产生抗癌活性代谢产物的放线菌，本发明属于生物制药领域。

背景技术：

癌症目前已经成为中低收入国家人民死亡的最主要原因，尤其对于中等收入国家来说由于经济的发展导致医学科学的进步，导致人口老龄化同时其他导致死亡的疾病的发生率迅速下降，相对的使癌症的致死率增加。而我国作为全球人口最多的发展中国家形势尤为严峻。自上世纪起，我国癌症发病人数就日益增加，近30年，我国癌症在死因中的构成比由20世纪70年代10.3％上升到22.3％，死亡率也由73.99/10万上升至135.88/10万。城市地区癌症为第一死因，农村地区为第二死因，癌症死亡的主要因素包括人口老龄化，吸烟，饮食习惯，肥胖等相关，而通过对我国居民营养与健康调查发现十年间我国居民的超重率和肥胖率分别上升了38.6％和80.6％。同时，癌症的诊断、治疗都会给病人，国家造成巨大的经济压力。

目前应对癌症的措施包括：预防，早期诊断，治疗。其中预防包括戒烟预防肺癌的发生率，注射疫苗来预防HCV感染从而预防病毒来源的肝癌的发生；对于癌症的治疗目前主要集中在药物治疗、手术治疗以及新兴的免疫治疗。手术治疗可以切除病灶，有时可以达到完全治愈癌症的目的，但是对于无法进行手术的晚期病人，对于癌症有效的控制，尽量延长生存时间同时保证生存质量成为非常重要的目标。相对于免疫治疗的高昂的治疗费用，传统的药物治疗成为了患者的首选，目前临床上应用的抗肿瘤药物都存在着一定的副作用同时由于长期应用也造成了耐药，因此新兴的抗肿瘤药物对于临床治疗癌症的重要作用不言而喻。

人类应用自然界中的物质提取得到药物来治疗疾病已经有几千年的历史了，从微生物中得到产物来治疗癌症也已有超过100年的历史。因此天然产物来源的药物一直是新药的重要来源。其中微生物来源的天然产物以青霉素应用最为广泛，在药物发现史上举足轻重。其中微生物中放线菌所产生的天然产物种类丰富，在医疗上应用广泛，可以产生多种生物活性物质，在抗菌，抗病毒，抗癌等方面都有应用。

放线菌是一类G+菌，G+C％含量丰富，在自然界有着广泛的分布，主要是以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是以有机物丰富，呈中性或微碱性的土壤中最多，由于近年对于海洋资源的研究深入，发现了海洋中的放线菌，丰富了放线菌的代谢产物，也增加了发现抗癌活性物质的机会。随着近几年微生物组计划的兴起，对人体内微生物的重视程度不断增加，在研究人体微生物与疾病关系的同时，我们不能忽略人体内的微生物的代谢产物也是生物活性物质非常重要的来源，由于人体内微生物的生存环境特殊，因此其非常有望成为微生物代谢产物的新来源，也就非常有可能产生新的抗癌物质。

本发明利用健康人肠道中的放线菌的代谢产物治疗癌症，通过对采集到的样本进行分离培养得到放线菌，并对放线菌扩大培养，得到其活性代谢产物，加入到传代培养的癌细胞中，培养6个小时，在镜下观察癌细胞形态，发现癌细胞出现固缩，死亡。说明来源于健康人肠道的放线菌的代谢产物具有抗癌的活性。

技术实现要素：

本发明的目的在于一株从人体肠道中分离的能产生抗癌活性代谢产物的放线菌BI87及其代谢产物和用途。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

(1)本发明以健康人粪便为样本，从中分离培养放线菌并检测其抗癌活性。

(2)针对分离得到的放线菌扩大培养，获得大量代谢产物。

(3)用包括HeLa细胞、NB4细胞等的癌细胞系进行代谢产物抗癌活性的验证。

(4)观察癌细胞的形态变化，并记录。

本发明发明人经分离和抗癌活性筛选最终从人体肠道中分离得到了一株能够产生抗癌活性代谢产物的放线菌，命名为BI87，分类命名为鲤链霉菌(Streptomyces carpaticus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.12598，保藏时间为2016年6月6日。

进一步的，本发明还提出了一种具有抗癌活性的代谢产物，其由本发明所述的放线菌BI87经培养后得到。

在本发明中，优选的，所述的具有抗癌活性的代谢产物是将本发明所述的放线菌BI87单菌落接种于高氏一号液体培养基进行培养，0-40℃培养5-7天，转速为150-200rpm，培养结束后，将菌液转移至高氏一号液体培养基中进行扩大培养，0-40℃培养8-12天，转速为150-200rpm，离心，取上清液，即为放线菌的代谢产物。

更进一步的，本发明还提出了所述放线菌及其代谢产物在制备抗癌药物中的用途。

相较于现有技术，本发明的优点在于：

(1)放线菌来源于人体肠道，是一种新来源的放线菌，具备其他土壤来源的放线菌不同的性质。

(2)由于其是在健康人体肠道内发现，对于人体的副作用很低或无。

(3)通过调节人体肠道微生物的状态或数量的比例的不同，从而达到预防癌症的目的。

(4)生产方便，价格低廉，降低癌症患者的经济负担。

附图说明

图1为HeLa细胞经过BI87代谢产物作用6h的结果；

图2为NB4细胞经过BI87代谢产物作用6h的结果；

图3为ZYZ(分离于临床中白血病患者的血液)白血病细胞经过BI87代谢产物作用6h的结果；

图4为BI87的进化位置；

图5为NB4细胞经过不同浓度的BI87代谢产物作用24h、48h、72hMTT的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1放线菌BI87的分离和鉴定

(一)以健康人粪便为样本，从中分离培养放线菌。

1、取样说明：

我们将交给每位粪便提供者一个取样包，包括以下物品：

50mL离心管x 1

勺子x 1

PE手套x 2

纸盘x 1

知情同意书x 1

取样说明说x 1

2、操作说明：

(1)详细阅读知情同意书，粪便提供者签字并详细填写基本信息。

(2)请尽量将粪便排到一次性纸盘中。

(3)带上PE手套，用勺子挖取粪便中心部分，约10g(大约达到离心管10mL

的刻度线处)，放入到50mL离心管内，拧紧离心管盖子后，放回自封袋中。

(4)整个操作过程尽量避免碰触其他不相关物品。

(5)尽量保证样本新鲜。

(6)请将装有粪便的离心管和知情同意书装入自封袋，由实验室人员集中收集回来。

(二)放线菌的分离培养：

1.取样，编号：1、2、3、4…。离心：8000rpm，30min。收集上清液。

2.将样品沉淀与高压灭菌后的沙子混合。室外风干一周。

3.碾碎，80℃恒温干热1h。

4.取1g处理完的样品溶于10mL PBS中振荡30min。

5.静置30s。

6.取上清进行10倍、100倍、1000倍稀释。

7.取10^-2，10^-3稀释管中的稀释液100μl分别涂平板(添加重铬酸钾)。

8.0-40℃培养5-10天。

9.取单菌落三道划线，0-40℃培养5-10天。

10.从三道划线的平板上取单菌落密涂，0-40℃培养5-10天。

11.存菌：刮取一定量的菌体到500μl高氏一号液体培养基中混匀后，加入500μl 50％甘油，-80℃存菌。

12.斜面：接种针挑取菌落插入斜面，反复插入，再在斜面上反复划线，0-40℃培养，备用。

试剂配制：

1)高氏一号固体培养基(1L)

2)培养基中重铬酸钾浓度为50mg/L(筛选时用，其他不用)。

配制过程中储存液浓度为5g/L。

3)FeSO₄·7H₂O母液：0.01g/mL

将1g FeSO₄·7H₂O溶于100mLH₂O，1000mL高氏一号琼脂培养基加入1mL硫酸亚铁母液。

4)PBS缓冲液(1L)

(三)针对分离得到的放线菌扩大培养：

将放线菌的单菌落接种于3mL高氏一号液体培养基进行扩大培养，28℃培养6天，转速为160rpm。培养结束后，将3mL菌液转移至100mL高氏一号液体培养基中进行扩大培养，28℃培养10天，转速为160rpm，离心，取上清液，即为放线菌的代谢产物。

培养HeLa细胞，传代培养以及铺板，每孔100μl，待HeLa细胞贴壁后向其中加入放线菌的代谢产物5μl，再培养六个小时后观察。镜下观察Hela细胞形态。NB4细胞的培养方式与HeLa相同。其中，HeLa细胞经过BI87代谢产物作用6h后的结果如图1所示；NB4细胞经过BI87代谢产物作用6h的结果如图2所示。从图中可以看出经过BI87代谢产物作用后，细胞出现了变圆、固缩以及死亡。

(四)从临床白血病病人血液样本中分离白血病细胞

1)将样本转移至15ml离心管，1500rpm离心10min。

2)吸出血浆置于-80℃保存后向15ml离心管中加入等倍血细胞体积的1640基础培养基混匀。

3)向另外一个15ml离心管中加入血细胞体积2倍的淋巴细胞分离液，并将与1640混匀的血细胞缓缓加到分离液液面上，2000rpm离心20min。

4)将最上层的1640基础培养基吸除后，其下呈云雾状层为淋巴细胞层，将淋巴细胞吸出后加入5-6ml PBS，1500rpm离心10min。

5)将离心后的细胞加入带有血清的1640培养基中培养，将此细胞系命名为ZYZ。

待ZYZ白血病细胞的密度达到1x10⁵/mL时，向培养的ZYZ白血病细胞100μL中加入放线菌的代谢产物5μL，培养六个小时后观察。ZYZ白血病细胞经过BI87代谢产物作用6h后的结果如图3所示。从图中可以看出白血病细胞经过BI87的代谢产物作用之后出现了固缩和死亡。

(五)放线菌BI87的分离和保藏

经分离和抗癌活性筛选最终得到了一株能够产生较高抗癌活性代谢产物的放线菌，命名为BI87，分类命名为鲤链霉菌(Streptomyces carpaticus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.12598，保藏时间为2016年6月6日。

(六)放线菌BI87的物种鉴定：

将可以产生抗癌活性物质的放线菌BI87进行三道划线培养后，邮寄至金维智生物科技有限公司进行16S rRNA测序及鉴定，测序结果如SEQ ID NO.1所示，将上述序列上传到NCBI数据库中比对发现BI87属于鲤链霉菌(Streptomyces carpaticus)。BI87的进化位置如图4所示。

实施例2不同浓度的BI87代谢产物对NB4细胞的MTT实验

培养NB4细胞，传代培养以及铺96板，每孔100μL，细胞密度为1x10⁶/mL，四周铺100μL的PBS缓冲液，避免培养过程中的液体蒸发，分别加入不同浓度的放线菌代谢产物(实施例1制备)，以三氧化二砷注射液(终浓度0.2μmol/L)为阳性对照，高氏一号液体培养基为阴性对照，各设6个重复孔，再培养6-72小时后观察。每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液(此处如果将紫色结晶物质吸出则会影响最终的结果)。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物质充分溶解。在酶联免疫检测仪OD492nm处测量各孔的吸光值。结果如图5所示，从图5可以看出随着培养时间以及放线菌代谢产物浓度的增加，BI87代谢产物对NB4细胞的抑制作用不断增强，说明本发明得到的BI87代谢产物对NB4细胞具有抑制作用。