本发明涉及一株聚磷菌——不动杆菌(Acinetobacter sp.)G2以及利用该菌实现从中低磷含量污水中回收磷的方法。
背景技术：
磷是生命的基本构成元素之一，人类工业生产和农业种植也对磷有着大量的需求。但是根据全球已探明的磷矿石储量以及人类的开采利用速度，磷矿将在200年左右时间被开采完毕。而我们人类对磷的利用使得磷有很大一部分都溶解在了各类工农业和生活污水当中。特别是大量的生活污水不仅给污水处理带来了巨大的压力，更导致磷元素流向各类水体造成水体富营养化。污水处理过程中的除磷工艺相对较为成熟，但是对磷的有效回收还十分缺乏，因此，研究从污水中具有可操作性的有效回收磷的技术具有重要的理论和应用价值以及环保意义。
强化生物除磷(Enhanced Biological Phosphorus Removal，EBPR)是利用活性污泥中的聚磷菌(Polyphosphate Accumulating Organisms，PAOs)在厌氧状态下向水体中释放磷，在好氧状态下以远远超过其生长需要的水平从水体中摄取磷的生物机理达到除磷的目的，该方法具有运行成本低，适应性广的特点。
磷酸铵镁结晶法(Magnesium Ammonium Phosphate，MAP)则是利用镁、铵根和磷酸根在溶液中达到过饱和状态时会生成磷酸铵镁结晶的原理对污水中的磷进行回收的方法，该方法能够很好的实现对高磷废水中磷的回收，且回收产物具有很高的氮磷含量。本发明对上述两种方法开展研究，将两种方法进行有机耦合，对实现从城镇污水中回收磷具有很强的操作性，为实际污水处理提供了理论依据。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一株具有强化生物除磷功能的聚磷菌——不动杆菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M 2015302。
本发明的聚磷菌分离自天津市纪庄子污水处理厂好氧池活性污泥，菌体呈球杆状，菌落边缘整起，湿润，革兰氏阴性，结合16S rDNA和BIOLOG微生物鉴定系统进行鉴定，命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.)G2。该菌已于2015年5月15日保藏在中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2015302。
本发明的第二个目的是提供利用聚磷菌——不动杆菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M2015302的强化生物除磷功能结合磷酸铵镁结晶法从中低磷含量的污水中回收磷的方法。
为实现这一目的，本发明采取的技术方案包括如下步骤：
(1)采用LB培养基30℃活化菌种12小时；
(2)按照1％-5％的比例将活化的聚磷菌回注到污水处理厂活性污泥中；
(3)以回注了聚磷菌的污水处理厂活性污泥接种，采用序批式活性污泥法进行驯化，每个循环包含厌氧-好氧-沉淀-换水，且循环之间交替使用丙酸和乙酸两种碳源，碳磷摩尔比C∶p＝13～20∶1，在20～37℃温度下驯化4周以上；其中，每12～24小时作为一个循环，每个循环包含5.5～11.5小时厌氧搅拌、5.5～11.5小时好氧曝气以及1小时用于沉淀、换水和闲置，其中，换水比例为40％-70％；交替使用丙酸和乙酸两种营养底物驯化；
(4)利用系统产生的剩余活性污泥进行厌氧消化处理，获得高含磷量的消化液；
(5)然后采用磷酸铵镁结晶法进行回收，每升添加0.3-0.7g石英砂作为晶种，控制在pH＝9.0～11.0，以氯化镁和氯化铵作为镁源和氮源，控制摩尔比Mg∶N∶P＝(1.3～1.7)∶(1.3～1.7)∶1.0，温度25～37℃、搅拌速率150-220rpm条件下结晶10min以上。
与现有其它的磷回收技术相比，采用该聚磷菌和该工艺方法，可以有效地降低从含磷量较低的污水中回收磷的难度，且能够很好地嵌入到当前常用的生物法污水处理工艺当中，工艺改造成本和运行成本较低，有利于磷的循环利用，具有良好的应用价值。
附图说明
图1为磷含量标准曲线。
具体实施方式
实施例中不同培养基及溶液配方如下：
1.LB培养基：1000ml水，10.0g蛋白胨，5.0g酵母浸粉，5.0g NaCl，pH7.0-7.2。
2.YG培养基：酵母提取物1g、葡萄糖1g、K2HPO4 0.3g、KH2PO4 0.25g、MgSO4 0.2g、去离子水1L。
3.筛选培养基：MOPS-BCIP培养基，首先配制10倍浓度MOPS溶液：加8.372g MOPS，0.717g Tricine，30mL去离子水，用10mol/L KOH调节pH至7.4，总体积到44mL，再加1mL新制0.01％FeSO4溶液后按顺序依次添加以下溶液：5mL 1.9mol/L NH4Cl，1mL0.276mol/L K2SO4，0.025mL 0.02mol/L CaCl2·2H2O，0.21mL 2.5mol/L MgCl2·6H2O，10mL 5mol/L NaCl，0.02mL微量元素混合液，38.7mL去离子水，葡萄糖0.1g。各取50mL 10倍浓度母液分装置两个三角瓶中，一瓶加入0.0087g K2HPO4成为限磷培养基； 另外一瓶加入0.1732g K2HPO4成为富磷培养基。向两种培养基中加入0.1g/mL的thiamine溶液0.01mL，加入去离子水分别定容至500mL，过滤除菌后保藏。在使用时加入50mg/L的BCIP。
4.检测培养基：乙酸钠5.0g/L、NH4Cl 0.5g/L、牛肉膏、胰蛋白胨0.5g/L、KH2PO4 0.1g/L、微量元素。
5.Albert法异染颗粒染色液：A液：59％乙醇2mL、冰醋酸1mL、甲苯胺蓝0.15g、孔雀绿0.2g、蒸馏水100mL。先将甲苯胺蓝和孔雀绿溶于乙醇，再加入混匀的水和冰醋酸。B液：碘化钾3g、碘2g、水300mL。
6.水中溶解性磷(以下简称“水磷”)含量测定主要所需溶液配方
过硫酸钾溶液：5g过硫酸钾溶于100mL蒸馏水；
硫酸：1∶1；
抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL蒸馏水中；
钼酸盐溶液：溶解13g钼酸铵于100mL蒸馏水中，溶解0.35g酒石酸锑钾于100mL蒸馏水中，在不断搅拌下，把钼酸铵溶液徐徐加入到300mL硫酸中，加酒石酸锑钾溶液并且混合均匀，贮存在4℃可稳定至少两个月。
KH2PO4标准储备溶液(含磷量50.0μg/mL)：将优级纯磷酸二氢钾于110℃干燥2h，在干燥器中冷却称取0.2197g溶于水，移入1000mL容量瓶中，加硫酸5mL，用水稀释至标线。
KH2PO4标准使用溶液(含磷量2.00μg/mL)：吸取10mL磷酸盐储备液于250mL容量瓶中，加水至标线，使用前临时配置。
7.模拟含磷废水：乙酸钠1.12g/L或丙酸钠0.677g/L、MgSO4 0.083g/L、NH4Cl 0.1065g/L、K2HPO4 0.064g/L、KH2PO4 0.0382g/L、CaCl2·2H2O 0.0795g/L、营养液0.575mL/L、pH7.0。营养液：FeCl3·6H2O 1.5g/L、H3BO3 0.15g/L、CuSO4·5H2O 0.03g/L、KI 0.18g/L、MnCl2·4H2O 0.12g/L、EDTA 10g/L、NaMoO4·2H2O 0.06g/L、ZnSO4·7H2O 0.12g/L、CoCl2·6H2O 0.15g/L。
实施例1、分离鉴定聚磷菌——不动杆菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M 2015302
实验材料来自天津市纪庄子污水处理厂A2/O工艺好氧池(52.8°N，117.11°E)。
具体实施步骤如下：在无菌操作下，将10mL活性污泥样品溶于90mL水中，加玻璃珠摇床振荡30分钟，将获得的混合液梯度稀释后，涂布于已制好的YG平板上，30℃培养2-3天。之后挑取不同形态菌落在YG平板上划线纯化。将纯化后的菌株分别转接于限磷和富磷的MOPS-BCIP平板上，30℃培养2-3天。在限磷和富磷培养基上均产生蓝斑的菌株初步认 定为聚磷菌。选取初筛菌株用Albert异染颗粒染色液染色，先用A液染色5分钟，再用B液冲去A液染色1分钟，具有异染颗粒的菌株即认定为聚磷菌。经过革兰氏染色、16S rDNA基因序列分析及BIOLOG鉴定确定该菌株为不动杆菌，命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.)G2；经保藏编号为：CCTCC M 2015302。
实施例2、不动杆菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M 2015302的除磷能力鉴定
采用检测培养基，具体步骤如下：采用LB培养基，30℃、180rpm活化。以1％接种量接种至含200mL检测培养基的500mL三角瓶中，好氧培养12h后厌氧培养4h，再好氧培养8h，通过检测上清P含量确定菌株除磷能力。
磷标准曲线的绘制
磷含量测定采用国标钼酸铵分光光度法(GB11893-89)。
标准曲线绘制：取7支50mL具塞比色管，分别加入磷酸盐标准使用液：0.00、0.10、0.20、0.60、1.00、2.00、3.00，加水至5mL；向7只比色管中加入800μL过硫酸钾溶液，放入高压灭菌锅中120℃消解30min；自然冷却后加水定容至10mL刻度线，加入200μL抗坏血酸溶液，30s后加入400μL钼酸盐溶液；显色15分钟后用分光光度计检测700nm下的吸光度，然后绘制标准曲线。标准曲线如说明书附图1所示。
不动杆菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M 2015302除磷能力测定
取接种培养前、后的检测培养基，离心取上清，分别制备50倍和100倍稀释液。各取5mL加入比色管，按照标准曲线制备的消解、显色方法进行处理，检测700nm下的吸光度，对照标准曲线，计算上清液P含量。不动杆菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M 2015302除磷效果为6.9mg/L。
实施例3、强化生物除磷实验
采用模拟含磷废水，理论P含量为17.4mg/L，C/P＝15∶1。采用2L规模的序批式活性污泥法，每24小时作为一个循环，每个循环包含11.5小时厌氧搅拌、11.5小时好氧曝气、20分钟沉淀、换水50％、40分钟闲置，交替使用丙酸和乙酸两种营养底物驯化。取1.0L取自污水处理厂的活性污泥与污水混合物，8000rpm、15分钟离心后将所得湿泥作为样品接种。在系统运行过程中检测每个循环厌氧结束、好氧结束和换水结束三个时刻的污水中的溶解性磷含量。
磷标准曲线的绘制和磷含量测定方法同实施例2。
运行4周时间后好氧出水P浓度平均为4.0mg/L，厌氧结束时的水磷P浓度平均为49.6mg/L。相比于模拟含量配水17.4mg/L的磷含量，此系统的除磷量为13.4mg/L，除磷率为77％。
实施例4、磷酸铵镁结晶法从模拟污水中回收磷的实验
采用模拟含磷废水，调整水磷浓度为150mg/L。具体步骤如下：调节pH＝10，按照摩尔比Mg∶N∶P＝1.5∶1.5∶1.0加入氯化镁溶液和氯化铵溶液作为镁源和氮源，加入0.5g/L石英砂作为晶种，30℃、180rpm振荡结晶30min。
磷标准曲线的绘制和磷含量测定方法同实施例2，对比结晶反应前后的磷含量变化，磷的回收效率为97.89％。
实施例5、磷酸铵镁结晶法从活性污泥厌氧消化液回收磷实验
采用实施例3实验中28天后好养结束时的活性污泥，离心浓缩后补加乙酸钠1g/L，50℃厌氧恒温水浴12小时，对污泥进行中温厌氧消化处理。获得磷含量为127.35mg/L的厌氧消化液。调节pH＝10，按照摩尔比Mg∶N∶P＝1.5∶1.5∶1.0加入氯化镁溶液和氯化铵溶液作为镁源和氮源，加入0.5g/L石英砂作为品种，30℃、180rpm振荡结晶30min，取得了75％的磷回收效率；获得白色磷酸铵镁结晶。