具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法与流程

本发明涉及一种筛选方法，具体的为一种具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法，属于微生物领域。

背景技术：

蓝藻，又称蓝绿藻、蓝细菌，是藻类生物中最简单、最原始的一种微藻。固氮蓝藻如念珠藻(Nostoc)、鱼腥藻(Anabaena)、单崎藻(Tolypothrix)等，均能够通过细胞中固氮酶的作用，将大气中游离态的分子氮还原成可供植物利用的氮素化合物，同时在其生长过程中不断分泌出多糖、氨基酸、多肽等氮类化合物及活性物质，在提高土壤肥力的同时促进作物生长。

Karthikeyan等研究了从小麦根际分离得到的三种蓝藻(Calothrix ghosei、Hapalosiphon intricatus、Nostoc sp.)对谷物产量的影响，结果表明，不同环境、不同蓝藻组合对谷物产量的影响不同，Hapalosiphon intricatus及三种蓝藻组合的使用使得谷物产量明显增加，Hapalosiphon intricatus及Nostoc sp.的组合的使用使得谷物的高度明显增高。Prasanna等通过研究宽松鱼腥藻(Anabaena laxa)、鱼腥藻(Anabaena sp.)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)对大米产量的影响，结果发现，三种微生物同时作用时，大米的产量较未加任何微生物的大米的产量提高了19.02％，每公顷节约N为40-80Kg。Kumar等研究了不同蓝藻及不同嗜热细菌组合对香料作物生长的影响，结果发现，添加只添加鱼腥藻的实验组的茴香种子发芽率较未添加微生物的实验组的茴香种子发芽率增加了25％，只添加了眉蓝细菌实验组的芽/根长度较未加任何微生物的实验组的芽/根长度增加了30％-50％。董俊德等在北京水稻田分离出固氮蓝藻6属15种。按每公顷接种1125kg鲜混合藻，该混合藻由念珠藻(BA02和BA03)、鱼腥藻(BA01)及少量筒孢藻(BA66)。分蘖期主要是固氮蓝藻和固氮菌共同固氮，抽穗期主要是蓝藻固氮。王秀红等在上海地区的水稻田施用鲜藻750kg/公顷，干藻80kg/公顷。藻种也是武汉水生生物研究所来的混合藻种。肥效和有机肥及化肥相当。齐永安等用武汉水生生物研究所在湖北大面积应用的8种单藻组成的混合藻，以及由南京和武汉引来的9个单藻组成的混合藻种在黑龙江尚志县做了水稻大田实验，增产效果明显。这些实验充分验证了固氮蓝藻作为微生物肥料对水稻的增产效果。

一般来说，筛选具有生物肥料潜力的蓝藻，先在实验室内对微藻的生长和固氮酶活性进行评价，再做花盆实验考察对微藻作物的萌发或增产效果，有些还需要在大田培养考察生长 情况。但是实验室筛选存在的问题有以下几个方面1)实验室内的生长评价一般是仅对单一藻种进行，而在实际应用中往往使用的是混合藻种；2)实验室内的固氮酶活性测定一般是在缺氮或限氮条件下进行的，实际应用时土壤中不会处于严格缺氮的状态，而且固氮酶活性在固氮蓝藻的生命周期中也是变化的，实验室内的考察指标仅具有参考价值；3)蓝藻对作物的增产机制也不仅限于固氮带来的土壤有效氮含量增加。此外，土壤的微生物种群非常丰富，即使接种了大量的固氮蓝藻，经过土壤微生物种群的动态调整，蓝藻在其中还是处于丰度较低的种群。由于多种固氮蓝藻之间可能存在相互抑制作用，蓝藻和土壤微生物间也存在相互作用，因此高效率的筛选多种固氮蓝藻组合是很有必要的。

高通量筛选是指以分子水平和细胞水平的试验方法为基础，以微板形式作为实验工具的实验过程，简言之是指通过一次实验可以获得大量信息，并从中找到有价值的信息。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高效的具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供了一种具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法至少包括：

1)准备3-10种候选的固氮蓝藻藻株、至少2种土壤中的细菌以及为微孔细胞培养板，设计藻-藻共生实验以及藻-菌共生实验将藻株和细菌接种在微孔细胞培养基上培养以评价不同固氮蓝藻以及固氮蓝藻和细菌之间的相互作用；

2)测定每组实验中的固氮蓝藻的叶绿素a以及细菌的CFU个数。

3)选出叶绿素a增加2mg/L以上以及细菌CFU个数超过2×106/L。

优选地,所述步骤1)中每个实验方案中固氮蓝藻的初始细胞接种密度为0.01-0.2g/L。

优选地,所述固氮蓝藻含有两种或者三种固氮蓝藻且每种固氮蓝藻的干重相同。

优选地,所述步骤1)中的细菌选自现有微生物菌种库或野外筛选到的土壤微生物，包括芽孢杆菌和解磷菌。

优选地,所述步骤1)中每种细菌的初始CFU为1×10⁵-2×10⁶L^-1。

优选地,所述步骤1)中的微孔细胞培养板的孔体积为3-5mL，培养基为BG11培养基，培养的温度为20-30℃，光照强度为70-120μmol/m²/s，光暗循环(光：暗＝14:10)，培养时间为6-8天。

优选地，所述步骤1)中的设计藻-藻共生实验以及藻-菌共生实验是根据高通量原理获得的实验方案。

优选地,还包括步骤3)设计盆栽实验验证固氮蓝藻对土壤肥力的影响。

优选地,所述步骤3)中盆栽实验培养温度20-30℃，光强度为50-150mol/m²/s，光暗循环(光：暗＝14:10)。

优选地,所述固氮蓝藻对土壤肥力的影响的判断指标为测定在土壤中加入固氮蓝藻的第10-15天测定土壤中有效磷、可溶性有机碳及总可溶性氮含量的变化量。

如上所述，本发明的蓝藻多糖的制备和使用方法，具有以下有益效果：采用本实验筛选出的固氮蓝藻可以从整体上反应出对土壤微生物的影响,并不局限于仅仅根据固氮的能力作为判断指标,所以评价结果更加符合实际应用；本实验筛选出的实验可以筛选出当具有多种藻共生时具有高效生物肥效力藻株，相对于在单一藻株存在的条件下的筛选结构更加符合现实需求。

附图说明

图1实施例1中固氮蓝藻与Btsk共培养7天后后叶绿素a含量的增加；

图2实施例1中固氮蓝藻与Pf共培养7天后后叶绿素a含量的增加；

图3实施例1中固氮蓝藻与细菌混合物共培养7天后后叶绿素a含量的增加；

图4a实施例1固氮蓝藻与细菌Btsk共培养7天后菌的CFU数量；

图4b实施例1固氮蓝藻与细菌Pf共培养7天后菌的CFU数量；

图4c实施例1固氮蓝藻与混合细菌共培养7天后菌的CFU数量；

图5A为实施例2中固氮蓝藻对土壤中有效磷的影响；

图5B为实施例2中固氮蓝藻对土壤中可溶性有机碳的影响；

图5C为实施例2中固氮蓝藻对土壤中总可溶性氮的影响。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1固氮蓝藻与两种菌的共生实验

选用固氮蓝藻中鱼腥藻B1611(购自美国德州大学UTEX藻种库)，念珠藻F280和鱼腥藻F243(分别购自中国科学院FACHB淡水藻种库)，三种土壤微生物苏云金芽孢杆菌肯尼亚亚种(Btsk)、荧光假单胞菌(Pf)(分别购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC))，编号分别为1.1012和1.867。

根据高通量实验原理，固氮蓝藻与细菌共生实验共设计31组实验，每组实验的培养体积为5mL，培养温度为27±2℃，光照强度为87.63±3.44μmol/m2/s，光暗循环(光：暗＝14:10)，培养基为BG11培养基，培养时间为7天，测定三种蓝藻的叶绿素a含量的变化、两种细菌的CFU个数。实验方案见表1。

叶绿素a的测定参考Pruvost等的方法【Pruvost J.,G.Van Vooren,B.Le Gouic,et al.,Systematic investigation of biomass and lipid productivity by microalgae in photobioreactors for biodiesel application.Bioresour Technol,2011.102(1):150-158】；CFU计数参考Lundholm等的方法【Lundholm I.M.,Comparison of methods for quantitative determinations of airborne bacteria and evaluation of total viable counts.Applied and Environmental Microbiology,1982.44(1):179-183】；

表1固氮蓝藻与两种菌共生实验方案设计表

实验结果：

参见图1，T9、T10以及T12实验组中的叶绿素a含量都较其相应的蓝藻无菌纯培养组(T1、T2和T4)高，说明加入苏云金芽孢杆菌Btsk可以促进相应蓝藻的生长(图1)。

参见图2和3，荧光假单胞菌Pf对藻类生长的影响有不完全相同的趋势。Pf同样促进F280的生长(T18)，但是对B1611和B1611+F280确有抑制作用。对三藻共培养实验组，加入Btsk后B1611+F280+F243的叶绿素有一定增加，但是加入Pf后则三种蓝藻的生长显著受到抑制。比较图2和图3可以发现，加入荧光假单胞菌Pf后F280+F243的叶绿素含量有一定增加，而加入Btsk+Pf对F280和F243共培养是不利的。除了对F280+F243共培养体系的影响不同外，加入Pf或同时添加Btsk和Pf对其它的蓝藻纯培养(B1611，F280和F243)或组合(B1611+F280，B1611+F243和B1611+F280+F243)的影响是一致的。说明荧光假单胞菌Pf对蓝藻生长的影响强于苏云金芽孢杆菌Btsk。

参见图4a，B1611、F280、F243纯培养及其混合培养对苏云金芽孢杆菌B生长的影响差异较大。其中B1611+Btsk组(T9)和B1611+F243+Btsk组(T13)中苏云金芽孢杆菌Btsk均有较好生长(CFU含量均为2.7×10⁶/L，显著高于初始值2.0×10⁶/L)，蓝藻的其余各组中苏云金芽孢杆菌Btsk的含量都明显低于初始接种值2.0×10⁶/L，说明B1611+B和B1611+F243可以促进苏云金芽孢杆菌菌Btsk的生长。

参见图4b，B1611+Pf(T17)、F280+Pf(T18)、B1611+F280+Pf(T20)、B1611+F243+Pf(T21)组中荧光假单胞菌Pf的CFU含量分别为3.1×10⁶/L、3.9×10⁶/L、2.5×10⁶/L、4.5×10⁶/L，均高于初始接种值2.0×10⁶/L，说明B1611、F280、B1611+F280、B1611+F243都能促进荧光假单胞菌Pf的生长，其中促进作用最明显的是B1611+F243，其次是F280。

参见图4c,B1611(T25)、B1611+F280(T28)与F280+F243(T30)组中细菌的CFU含量分别为1.8×10⁶/L、1.5×10⁶/L、0.9×10⁶/L，低于初始接种值2.0×10⁶/L，说明B1611、B1611+F280与F280+F243对混合的细菌(Btsk+Pf)生长具有抑制作用，B1611+F280+F243(T31)对Btsk+Pf略有促进，其余各组都对B+P有很强的促进作用。

通过实施例1中的测定，F280可以作为候选藻株。

实施例2盆栽实验

为判断实施例1中单一蓝藻及不同蓝藻组合对土壤肥力的影响进行盆栽土壤实验，共设计8组实验，培养温度22℃，光强度为64.33±17.62mol/m2/s，光暗循环(光：暗＝14:10)， 第6天测定土壤中有效磷、可溶性有机碳、总可溶性氮的含量，实验设计方案见表2。

土壤有效磷的测定参考Watanabe等的方法【Watanabe F.S.,S.R.Olsen,Test of an Ascorbic Acid Method for Determining Phosphorus in Water and NaHCO3Extracts from Soil.Soil Science Society of America Journal,1965.29(6):677-678】；可溶性有机碳、总可溶性氮含量的测定参考Techtmann等的方法【Techtmann S.M.,J.L.Fortney,K.A.Ayers,et al.,The unique chemistry of eastern Mediterranean water masses selects for distinct microbial communities by depth.PloS one,2015.10(3):e0120605】。

表2花盆土壤实验方案设计表

参见图5A，所有的蓝藻处理组的AP(有效磷)含量均高于空白对照组，其中T3(F243组)、T5(B1611+F243组)和T6(F280+F243组)的AP含量显著高于空白对照组；其余各组AP含量虽略高于空白对照组。

参见图5B，所有蓝藻处理组的DOC(可溶性有机碳)含量均不低于空白对照组。其中T5组(B1611+F243组)显著高于空白对照组；T2(F280)、T4(B1611+F280)、T6(F280+F243)和T7(B1611+F280+F243)组显示其平均值亦远高于空白对照组。

参见图5C，各组之间的TDN(总可溶性氮)含量的差异较大，其中T4(B1611+F280)、T5(B1611+F243)、T6(F280+F243)和T7(B1611+F280+F243)各组的平均值略低于空白对照组；T2(F280)组的平均值高于空白对照组；T1(B1611)和T3(F243)组TDN显著高于空白对照组。

综合实施例1和实施例2的结果，可以看到在所有31组藻菌组合中，既有利于蓝藻又有助于细菌生长的蓝藻体系为F280纯培养组。

添加细菌的F280组在叶绿素a含量上均具有很大的优势(图1、2、3)，F280在促进细菌生长的方面也较好，但对于细菌Btsk的促长作用略小(图4a)。实验室筛选结果表明，F280较其它实验组更适合开发成生物肥。土壤分析上来看，F280对于土壤AP含量、DOC含量和TDN含量都有一定的提升作用，说明实验室筛选方法是可行的。可以在有大量备选藻种和菌种，藻菌组合数量比较大的情况下，便捷、有效地筛选具有应用于微藻生物肥潜力的蓝藻。

实施例3固氮蓝藻与两种菌的共生实验

选用固氮蓝藻中鱼腥藻B1611(购自美国德州大学UTEX藻种库)，念珠藻F280和鱼腥藻F243(分别购自中国科学院FACHB淡水藻种库)，三种土壤微生物苏云金芽孢杆菌肯尼亚亚种(Btsk)、荧光假单胞菌(Pf)和枯草芽孢杆菌(Bs)(分别购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC))，编号分别为1.1012、1.867和1.4255。

根据高通量实验原理，固氮蓝藻与细菌共生实验共设计63组实验，每组实验的培养体积为3mL，培养温度为20℃，光照强度为87.63±3.44μmol/m2/s，光暗循环(光：暗＝14:10)，培养基为BG11培养基，培养时间为8天，实验方案见表3。

表3固氮蓝藻与三种菌共生实验方案设计表

采用和实施1中相同的实验原理设计实验方案，最终测定固氮蓝藻的叶绿素a和细菌的CFU的数量，结果表明F280或F280+F243可以作为开发生物肥的藻株。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。