一种检测马铃薯青枯病菌的引物及其PCR检测方法与流程

本发明涉及一种检测引物及其PCR检测方法。

背景技术：

马铃薯青枯病(Potato bacterial wilt)，又名细菌性枯萎病。从发生地域或危害性来说，青枯病是马铃薯病害中仅次于晚疫病的一种常见病和多发病，为世界性重大细菌性病害。青枯病分布范围极广，主要分布在温暖潮湿、雨量充沛的热带和亚热带地区。由于青枯病较难控制，既无免疫抗原，又可经土壤传染，一旦发生青枯病，发病田块大幅度减产，发病重的产量损失达80％左右。

此病是由一种称为青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的细菌侵染引起的。此菌是一种维管束寄生的植物病原细菌，病菌侵入维管束后迅速繁殖，并堵塞导管，妨碍水分运输，最后导致植株萎蔫。此种细菌的寄主范围很广，可侵染33科100余种植物，除茄科蔬菜如番茄、茄子、辣椒等外还侵染烟草、芝麻、花生、大豆、萝卜等多种农作物，病菌生长发育最适温度为30-37摄氏度，是一种要求高温的细菌，对湿度的要求也较高。该菌主要随病残体留在田间或马铃薯块上越冬，无寄主时，病菌可在土中营腐生生活长达14个月～6年，是一种顽固的兼性腐生菌。

青枯病是危害严重的病害。一般幼苗期较少显症，多在现蕾开花后表现急性显症，染病植株比健株稍矮缩，叶色较浅，在晴天的午间一般是上部个别小叶或复叶出现萎蔫，晚间及清晨尚可恢复，以后逐渐加重，致全株叶片萎垂不能再恢复，全株茎叶萎蔫死亡，但仍保持青绿颜色，叶片亦不脱落，随后叶脉逐渐变褐，茎部亦出现褐色条纹。病株所结薯块如染病轻，外表无明显症状，染病重的脐部变灰褐色湿润状，切开病薯，维管束环变褐，稍挤压亦溢出污白色细菌脓液，严重的块茎外皮龟裂，髓部软腐溃烂。此病对马铃薯有潜伏侵染，外表虽无明显症状，但因细菌已侵入并潜伏薯块内，在贮运销售期间，若条件合适就会继续发展及致引起块茎大量腐烂。

常用的马铃薯青枯病菌鉴定检测方法如革兰氏染色法和血清学方法。革兰氏染色法需要加上对菌体形态特征进行观察，对生理生化反应特性进行测定，才能最终判定，这种检测方法需要对病原菌进行分离和纯化，试验的结果因培养温度、培养时间长短、培养基成分和确定阴性阳性的标准不同而变化，稳定性差，且费时费力，不便于生产上的应用。血清学方法尽管灵敏度有所提高，但仍然存在缺点，在与其它相近病菌的交叉反应或制备的抗血清不能和所有的待检测的某一种病菌的所有菌株杂交。随着分子生物学技术在许多领域的发展和应用，尤其是利用各种生物所特有的基因组碱基序列，而发展起来的特异性聚合酶链反应(PCR)技术的应用，但是这种技术对检测过程需要严格的要求，引物方面也是关键，不同的引物对检测结果影响较大，对检测范围，检测的灵敏度，特异性等均有很大的影响。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有方法对马铃薯青枯病的病原菌检测范围窄，特异性差，灵敏度差，检测效率低的问题。而提供了一种检测马铃薯青枯病菌的引物及其PCR检测方法。

本发明的一种检测马铃薯青枯病菌的引物，该引物对如下：

QK5-1：5'-GCTAATACCGCATACGAC-3'

QK3-1：5'-GAGCGTCAGTGTTATCCC-3'。

本发明的一种检测马铃薯青枯病菌的PCR方法，它是按照以下步骤进行的：

一、提取待检测样本的基因组DNA；

二、以权利要求1的引物作为检测引物，步骤一提取的DNA作为模板，进行PCR扩增反应；

三、PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳；

四、对扩增片进行分析：在591bp位置有扩增条带，表示样品为阳性，待检测样品中含有铃薯青枯病菌。

本发明包含以下有益效果：

本发明的马铃薯青枯病菌PCR检测引物，该引物可以对引起马铃薯青枯病的病原菌Ralstonia solanacearum四种生化型(BV Ⅱ～BV Ⅴ)的菌株进行扩增检测，检测范围广泛。检测特异性好，可以避免其它马铃薯细菌病原物产生的非特异性扩增。检测灵敏度可以达到1pg的模板DNA。检测效率高，检测样品可以是马铃薯植株DNA、块茎DNA，甚至可以直接以菌液作为模板进行PCR检测。

本发明的检测引物，检测特异性强，定性检测效果好。在常见的马铃薯病害环腐病、黑胫病、软腐病和晚疫病等病原菌内均无扩增条带出现，仅有青枯病菌能够获得目的片段。(避免了陈永芳等2005年利用RAPD法建立的PCR检测法中环腐病和黑胫病有扩增条带，只是带型不同的问题)。

附图说明

图1为实施例1中DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中，1-6泳道分别为：RS1～6的青枯病菌；

图2为实施例1中退火温度优化的电泳图；

图3为实施例1中马铃薯青枯病菌PCR扩增电泳图；其中，M为DL2000；1：阴性对照；2～13：RS1～12的DNA电泳图；

图4为实施例1中PCR检测的特异性鉴定电泳图；其中，M：DL2000；1：阴性对照；2～4：RS1～4的DNA电泳图；6～8：马铃薯黑胫病菌DNA电泳图；9～11：马铃薯环腐病菌DNA电泳图；12～14：马铃薯晚疫病菌DNA电泳图；

图5为实施例1中PCR检测的灵敏性鉴定电泳图；其中，M为DL2000；1：阴性对照；2～7表示：1ng，100pg，10pg，lpg，100fg，10fg的样品电泳图；

图6为实施例2的广西省、广东省、福建省的样品扩增电泳图第一批；其中，由左至右顺序依次为Marker DL2000、水对照、阴性对照、1-1～6、2-2～4、3-1～12；

图7为实施例2的广西省、广东省、福建省的样品扩增电泳图第二批；其中，由左至右顺序依次为Marker DL2000、3-13～16、5-1～4；

图8为实施例2的广西省、广东省、福建省的样品扩增电泳(引物RS32和RS37)第一批；其中，由左至右顺序依次为Marker DL2000、水对照、阴性对照、1-1～6、2-2～4、3-1～12；

图9为实施例2的广西省、广东省、福建省的样品扩增电泳(引物RS32和RS37)第二批；其中，由左至右顺序依次为Marker DL2000、3-13～16、5-1～4；

图10为实施例2的内蒙古的四个样品和标准菌株同时进行两对引物的扩增电泳结果图；其中A为本发明的引物扩增后电泳图，B为检疫标准推荐引物扩增后电泳图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种检测马铃薯青枯病菌的引物，该引物对如下：

QK5-1：5'-GCTAATACCGCATACGAC-3'

QK3-1：5'-GAGCGTCAGTGTTATCCC-3'。

具体实施方式二：本实施方式的一种检测马铃薯青枯病菌的PCR方法，它是按照以下步骤进行的：

一、提取待检测样本的基因组DNA；

二、以权利要求1的引物作为检测引物，步骤一提取的DNA作为模板，进行PCR扩增反应；

三、PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳；

四、对扩增片进行分析：在591bp位置有扩增条带，表示样品为阳性，待检测样品中含有铃薯青枯病菌。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：PCR扩增的PCR体系如下：

PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，50～63℃退火40s，72℃延伸100s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一中提取基因组DNA，是从马铃薯植株或马铃薯块茎提取。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是：基因组DNA提取步骤如下：

一、取马铃薯块茎或马铃薯植株0.1g放入匀浆管中，再加入2mL匀浆缓冲液，将材料立即破碎后将液体抽出，放在5mL离心管中后，加入20μL巯基乙醇，立即在65℃水浴中过夜；

二、将上一步的离心管从水浴锅中取出后，加入等体积饱和酚，盖紧离心管，来回颠倒离心管在20min内混匀；

三、在10000rpm转速下离心10min，用移液管小心取出上清液，放另一离心管中，弃下层有机相；

四、向步骤三取的上清中加入等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇后来回颠倒离心管，混合10min后，在10000rpm转速下离心10min，重复此步骤1-2次，直至取出的水相加入有机溶剂时无白色云雾状物；

五、取上步骤四离心后的上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，混合10min，在10000rpm转速下离心10min；

六、取上一步离心后的上清，加入2倍体积的冻存后的无水乙醇，水平旋转50～100转后，在-20℃冰箱中放置30min以上，沉淀DNA；

七、将上一步放置于-20℃的离心管取出，在10000rpm转速下离心10min后，收集沉淀，得DNA；

八、向上一步得到的DNA中加入1mL体积百分含量为75％的乙醇，来回颠倒数次离心管，在8000rpm转速下离心4～5min，倒掉乙醇，将管倒置在干净的吸水纸上，干燥DNA沉淀；

九、向上一步干燥后的DNA中加入100-200μL灭菌的去离子水，在55℃水浴中溶解DNA；

十、向上一步的提取液中加入1μL的RNase，在常温下放置30min，然后用0.1％的凝胶进行电泳检测，-20℃冰箱中保存。其它与具体实施方式二相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明有益效果：

实施例1

1、试验材料

本实施例所采用的马铃薯青枯病菌菌株如表1所示，菌株RS1～4由国际马铃薯中心(简称CIP)提供用于科学研究，其余菌株均为本课题组通过TZC分离培养基对马铃薯青枯病感病植株进行分离纯化后，制成水溶液置于4℃冰箱保存备用。

表1供试菌株名称和来源

2、试验方法

2.1、试验所用细菌的基因组DNA提取

DNA提取方法参见商品化试剂盒的说明书。

2.2、马铃薯块茎的DNA提取

1、取马铃薯块茎0.1g放入匀浆管中，再加入2mL匀浆缓冲液，将材料迅速破碎后将液体抽出，放在5mL离心管中后，加入20μL巯基乙醇，迅速在65℃水浴中过夜；

2、将离心管从水浴锅中取出后，加入等体积饱和酚，盖紧离心管。缓慢来回颠倒离心管至少20min以混匀。不要过于剧烈，以防将DNA打断；

3、10000rpm离心10min。含DNA的水相在上层，含蛋白质和细胞碎片的有机相在下层；

4、用移液管小心取出上清液，放另一离心管中，弃下层有机相；

5、加入等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇后缓慢来回颠倒离心管，混合10min后10000rpm离心10min。重复此步骤1-2次，直至取出的水相加入有机溶剂时看不到白色云雾状物；

6、取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，混合10min，10000rpm离心10min。

7、取上清，加入2倍体积的、冰冷的无水乙醇，水平旋转50～100转后放在-20℃冰箱中30min以上，沉淀DNA；

8、将离心管取出，10000rpm离心10min后，可见管的下方有沉淀，即DNA；

9、小心地倒掉液体，加入1mL 75％的乙醇，来回颠倒数次离心管，以移去沉淀块中可能有的异物，8000rpm离心4-5min，小心倒掉乙醇，将管倒置在干净的吸水纸上，让乙醇流尽，干燥DNA沉淀；

10、根据沉淀块的大小加入100-200μL灭菌的去离子水，在55℃水浴中溶解DNA；

11、为了去除提取到的RNA，在提取液中加入1μL RNase，在常温下放置30min，然后用0.1％的凝胶进行电泳检测。-20℃冰箱中保存。

上述步骤提取DNA的方式，也可以从植株体中提取DNA。

2.3、PCR特异性引物的设计

根据Genebank中的登录号为DQ924957的Ralstonia solanacearum strain TW56 16S rRNA序列，使用Primers5.0软件设计马铃薯青枯病菌的特异性扩增引物，引物由上海生工生物公司合成，引物序列如下：

QK5-1：5'-GCTAATACCGCATACGAC-3'

QK3-1：5'–GAGCGTCAGTGTTATCCC-3'；

目的片段长度为591bp。

2.4、PCR扩增

PCR的反应体系均为25mL。PCR反应条件确定主要是对扩增程序的最适退火温度。

2.4.1.PCR反应体系

2.4.2.PCR反应条件的优化

对PCR反应条件中退火温度进行优化：

2.4.5.PCR检测体系的特异性验证

用设计合成的特异性引物对所供试病菌DNA进行PCR扩增，分别以马铃薯青枯病菌(RS1～4)、马铃薯黑胫病菌(BYH2、GSH1、NMH1)DNA、马铃薯环腐病菌(by06-6、hc-42、p06-4)DNA、马铃薯晚疫病菌(ch10、ch11、ncppb)DNA为模板，检测PCR检测体系的特异性。

2.4.6.PCR检测体系的灵敏度验证

为鉴定所设计引物及PCR反应体系所能测定的DNA最小浓度，将提取的DNA依次稀释成1ng，100Pg，10Pg，1Pg，100fg，10fg的6个不同浓度，用设计的引物进行PCR扩增，根据凝胶电泳结果测定引物的灵敏度。扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

3、试验结果

3.1青枯病菌基因组DNA提取

将所提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。从图中可看出，获得的DNA完整，质量较好，没有降解，能够满足PCR分离基因的要求，可以用于进一步的试验。

4、PCR的扩增

4.1退火温度的筛选

对马铃薯青枯病菌常规PCR反应条件进行优化，优化的条件为退火温度。筛选结果如图2所示。结果显示：59℃为最适退火温度。

4.2PCR扩增

用马铃薯青枯病菌特异性引物对供试12个青枯病菌菌株进行PCR扩增，结果见图3。

4.3PCR检测的特异性鉴定

用马铃薯青枯病菌特异性引物对供试菌株的DNA进行PCR扩增，结果如图4。由图可以看出，所用的青枯病菌都能扩增出大小为591bp的条带，而其他参考病原菌及对照均未扩增出条带，说明设计的引物对青枯病菌具有高度的特异性。

4.4PCR检测的灵敏性鉴定

采用马铃薯青枯病菌特异性引物对稀释成1ng，100pg，10pg，lpg，100fg，10fg的共6个不同浓度的青枯病菌基因组DNA进行PCR扩增，结果如图5所示。由结果可以看出检测到最低浓度为1pg的模板DNA。

4.5目的片段测序

将经过鉴定的阳性菌液送到上海生物工程技术服务有限公司进行测序，序列如下(下划线部分为引物)。

AAATCGGTCAGTGCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGAGCGTCAGTGTTATCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGACACACTCTAGCCGTGCAGTCACCAATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATCGGTCTTGCACAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGGACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTCCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCGACCCCAGGTATTAACCAGAGCCATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATCAGACATCGGCCGCTCCTATAGCATGAGGCCTTGCGGTCCCCCACTTTCACCCTCAGGTCGTATGCGGTATTAGCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAGGCGGTAATACGGTATCCACAGATCAGGGGATACGCAGAAAGACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAGGCCAGGACCGTAAAAGGCGCGTTGCTGGCGTTTTCCATAGG。

实施例2

本实施例应用本发明的PCR引物和检疫标准推荐PCR检测引物，对采自我国广西省、广东省、福建省、内蒙古等省份的35份感染细菌病害的样品进行比较试验。

1材料与方法

1.1样品

健康马铃薯植株(阴性对照)由黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所提供。

马铃薯青枯病标准菌株Ralstonia solanacearum购买自中国科学院微生物保藏中心。

待测样品：从我国广西省、广东省、福建省、内蒙古等地区马铃薯产区采集，见表2。

表2样品信息

1.2试剂

TaqDNA聚合酶、dNTP、购自TaKaRa(大连)公司，引物合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3植物基因组DNA提取

按照天根新型植物基因组DNA提取试剂盒说明书推荐方法提取块茎DNA。

1.4 PCR扩增

供试引物序列见表3。本发明的引物QK5-1和QK3-1的退火温度为59℃，而检疫标准推荐的引物RS32和RS37的退火温度为60℃。扩增产物经凝胶成像系统观察。

表3引物序列

2结果分析

2.1本发明引物的扩增结果

供试样品经引物QK5-1和QK3-1扩增后结果见图6和图7，从图中可知，广西省检出4份青枯病样品；广东省16份样品均检出青枯病菌；福建省4份样品的青枯病菌检测呈现弱阳性。

2.2检疫标准推荐引物的扩增结果

供试样品经已知检疫标准中推荐的引物扩增结果见图8和图9，从图中可知，广西省的样品(1-1～6、2-2～4)均为阴性；广东省16份样品均检出青枯病菌；福建省4份样品的青枯病菌检测呈现弱阳性。

2.3两对引物的扩增效率比较

以内蒙古的四个样品和标准菌株同时进行两对引物的扩增，电泳结果见图10。从图中可知，标准菌株的DNA浓度为20ng/μL，自行设计的引物QK5-1和QK3-1扩增获得目的产物，而RS32和RS37则未获得目的产物。待测样品的扩增效率方面，自行设计的引物QK5-1和QK3-1优于推荐引物RS32和RS37。

上述结果表明本发明所建立的PCR检测体系，准确率比推荐的检测方法更高，扩增效率也更高。