本发明涉及一种南瓜籽粕分子肽的方法，特别涉及一种混合菌固态发酵南瓜籽饼粕制备南瓜籽粕分子肽的方法。
背景技术：
南瓜籽饼粕中含有粗蛋白质70%-75%，粗脂肪5%-7%，粗纤维5%-6%。除此之外，南瓜籽饼粕中矿物元素和氨基酸含量也较多。南瓜籽榨油后，除油脂含量降低外，其他营养成分基本全部保留在南瓜籽饼粕中，但国内工厂一般对南瓜籽饼粕做饲料处理，并没有发挥其潜在的经济价值。
肽是各种蛋白质的一种特殊的分子量的形式，但通过水解大大改变了其功能特性。随着其水解度增加，水溶性也随之增加，乳化性和起泡性均随水解度的增加而先增加再降低，其粘度下降，体外消化性指数随水解度增加而提高，这类易吸收的肽可以作为肠道营养剂成流质食物形态提供给特殊身体状态下的人。南瓜籽饼粕分子肽具有调节血压，降低胆固醇，促进脂肪代谢，提高机体免疫力，延缓衰老等功能，而且对多种肿瘤细胞具有诱导分化，诱导凋亡和抑制增殖作用，其应用前景非常广泛，市场潜力巨大。
目前，我国对南瓜籽粕分子肽的生产还处于初级阶段，主要集中在酶法水解南瓜籽粕蛋白粉，此类加工方法不但成本高，还产生一定程度的苦味（酶解后产生的一些特殊的寡肽—苦味肽），在食品加工领域很难得到推广。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种混合菌固态发酵南瓜籽饼粕制备南瓜籽粕分子肽的方法，工艺简单易行，适合工业化生产，成本低，南瓜籽粕分子肽的转化率高，极大改善了南瓜籽粕分子肽的口感和风味，所得南瓜籽粕分子肽易于吸收。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种混合菌固态发酵南瓜籽饼粕制备南瓜籽粕分子肽的方法，包括如下步骤：
（1）乳酸菌发酵：把乳酸菌与已灭菌的米粉按照1:4-6的重量比混匀得乳酸菌米粉混合物，将乳酸菌米粉混合物投入发酵培养基中混合均匀，乳酸菌米粉混合物用量为发酵培养基重量的10-15%，35-40℃发酵培养；将乳酸菌与已灭菌的米粉混合后再投入发酵培养基发酵，这样接种更加均匀，同时增加碳源，提高乳酸菌存活率高，发酵效果好；经过乳酸菌发酵，降低发酵培养基的pH值，使其更适合黑曲霉生长。乳酸菌产生的乳酸菌细菌素，具有抑制和杀死发酵培养基中多数革兰氏阳性致病菌和腐败菌。抑制杂菌和致病菌生长。同时，乳酸菌产生的一系列酶对南瓜籽粕蛋白的分解起到重要作用。
（2）黑曲霉发酵：当乳酸菌发酵培养至发酵培养基的pH降至4.5-5.0时，接入黑曲霉孢子粉，黑曲霉孢子粉用量为发酵培养基重量的15-18%，32-35℃发酵培养70-72小时得发酵产物，黑曲霉发酵培养前24小时的通空气量为4000-4500m3/h，发酵培养25-49小时的通空气量为2500-3500m3/h，在发酵培养至50h时，向发酵培养基中补加发酵培养基重量15-20%重量的营养液，同时控制通空气量为900-1100m3/h至发酵结束；通过控制特定的发酵通气量的变化，发酵效果好，南瓜籽粕分子肽的转化率高，极大改善了南瓜籽粕分子肽的口感和风味；
（3）南瓜籽粕分子肽的提取分离：将发酵产物按1:20-25的重量比与水混合，55-60℃搅拌浸泡4-6小时，经板框压滤，滤液经截留分子质量10000道尔顿的中空纤维柱过滤截留，得超滤液，超滤液经减压浓缩，上大孔树脂柱吸附，洗脱，洗脱液减压浓缩后，喷雾干燥，得南瓜籽粕分子肽。
本发明开了了全新的利用微生物固态发酵水解南瓜籽饼粕制备南瓜籽粕分子肽，不但成本低廉，而且能去除由于疏水性氨基酸带来的苦味。
本发明采用乳酸菌，黑曲霉混合发酵制备南瓜籽粕分子肽。先将乳酸菌接种于蒸煮好的南瓜籽粕中，将南瓜籽粕基质的PH降至黑曲霉发酵的最适条件；再将黑曲霉接种于南瓜籽粕基质中进行混合发酵。在这发酵过程中，随着PH的变化，黑曲霉可产生碱性蛋白酶，中性蛋白酶和酸性蛋白酶，用它作为蛋白酶液比一般商品具有更多的酶切位点，可大大提高水解率。同时，通过微生物的作用对某些苦味基因进行修饰和转移、重组，极大改善了分子肽的口感和风味。在发酵过程中，小肽氨基酸又经过代谢、同化，将南瓜籽粕蛋白转化为生物流动肽，易于吸收。
作为优选，步骤（1）中所述发酵培养基按重量百分比计组成如下：南瓜籽饼粕粉70%，南瓜籽壳粉10%，水20%；pH自然，121℃、灭菌半小时，降温至35-40℃。采用南瓜籽饼粕粉与南瓜籽壳粉作为发酵培养基，这样发酵效果佳，也能有效利用南瓜籽壳。
作为优选，所述南瓜籽饼粕粉为南瓜籽饼粕粉碎后而得，南瓜籽饼粕粉大小在40-60目，南瓜籽壳粉的大小在20-40目。
作为优选，步骤（1）中乳酸菌的制作方法为：在500L水中加入50-70kg全脂奶粉及45-55kg蔗糖，加热搅拌溶解，115℃、0.1MPa下灭菌30-60min，冷却至40-42℃，然后加入5-10kg乳酸菌粉搅拌均匀，保持温度40-42℃小发酵培养8-12小时。
作为优选，步骤（2）中黑曲霉孢子粉的制作方法为： 将黑曲霉斜面菌种用无菌水洗出，制成黑曲霉孢子浓度为2×106 -7×106个/mL的黑曲霉孢子悬液，把黑曲霉孢子悬液加至活化培养基中，35-38℃培养24-26小时，然后和灭菌过的南瓜籽壳粉混合按照1:1.5-2.5的重量比例混合得黑曲霉孢子粉。
作为优选，所述活化培养基的原料重量百分比组成为：麸皮56%、南瓜籽饼粕粉10%、NaH2PO42%、MgSO41%、NaNO30.5%、酵母膏0.5%、水30%，pH自然、121℃、灭菌半小时、降温至35-40℃。
作为优选，步骤（2）中营养液按重量百分比计的配方为：葡萄糖浓度3%，磷酸二氢钾1.6%，烟酸2.2‰，胆碱1.8‰，叶酸2.23‰，VB2 2.8‰，水余量。
作为优选，步骤（3）中大孔树脂柱的树脂为大孔树脂D3520，大孔树脂柱吸附、洗脱的工艺参数为：样品以2BV/h的流速上大孔树脂柱,然后用20%乙醇溶液冲洗至流出液为无色时改用70%乙醇溶液洗脱，收集70%乙醇溶液洗脱的洗脱液。
作为优选，20%乙醇溶液冲洗的流速为4BV/h，70%乙醇溶液洗脱的洗脱速度为2BV/h。
作为优选，步骤（3）中喷雾干燥的通风温度为210℃，出风温度95℃，进料流量为30L/h。
本发明的有益效果是：工艺简单易行，适合工业化生产，成本低，南瓜籽粕分子肽的转化率高，极大改善了南瓜籽粕分子肽的口感和风味，所得南瓜籽粕分子肽易于吸收。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：
一种混合菌固态发酵南瓜籽饼粕制备南瓜籽粕分子肽的方法，包括如下步骤：
（1）乳酸菌发酵：把乳酸菌与已灭菌的米粉按照1:4的重量比混匀得乳酸菌米粉混合物，将乳酸菌米粉混合物投入发酵培养基中混合均匀，乳酸菌米粉混合物用量为发酵培养基重量的10%， 35-40℃发酵培养；所述发酵培养基按重量百分比计组成如下：南瓜籽饼粕粉（40-60目）70%，南瓜籽壳粉（20-40目）10%，水20%；pH自然，121℃、灭菌半小时，降温至35-40℃。乳酸菌的制作方法为：在500L水中加入50kg全脂奶粉及45kg蔗糖，加热搅拌溶解，115℃、0.1MPa下灭菌30-60min，冷却至40℃，然后加入5kg乳酸菌粉（市售）搅拌均匀，保持温度40℃小发酵培养12小时得酸奶状产物。
（2）黑曲霉发酵：当乳酸菌发酵培养至发酵培养基的pH降至5.0时，接入黑曲霉孢子粉，黑曲霉孢子粉用量为发酵培养基重量的15%，32℃发酵培养72小时得发酵产物，黑曲霉发酵培养前24小时的通空气量为4000m3/h，发酵培养25-49小时的通空气量为2500m3/h，在发酵培养至50h时，向发酵培养基中补加发酵培养基重量15%重量的营养液，同时控制通空气量为900m3/h至发酵结束。
黑曲霉孢子粉的制作方法为： 将黑曲霉斜面菌种用无菌水洗出，制成黑曲霉孢子浓度为7×106个/mL的黑曲霉孢子悬液，把黑曲霉孢子悬液加至活化培养基中，35℃培养26小时，然后和灭菌过的南瓜籽壳粉混合按照1:1.5的重量比例混合得黑曲霉孢子粉。活化培养基的原料重量百分比组成为：麸皮56%、南瓜籽饼粕粉10%、NaH2PO42%、MgSO41%、NaNO30.5%、酵母膏0.5%、水30%，pH自然、121℃、灭菌半小时、降温至35-40℃。
营养液按重量百分比计的配方为：葡萄糖浓度3%，磷酸二氢钾1.6%，烟酸2.2‰，胆碱1.8‰，叶酸2.23‰，VB2 2.8‰，水余量。
（3）南瓜籽粕分子肽的提取分离：将发酵产物按1:20的重量比与水混合，55℃搅拌浸泡6小时，经板框压滤，滤液经截留分子质量10000道尔顿的中空纤维柱过滤截留，得超滤液，超滤液经减压浓缩，样品以2BV/h的流速上大孔树脂柱（大孔树脂D3520）吸附，然后以4BV/h流速，用20%乙醇溶液冲洗至流出液为无色时改用70%乙醇溶液洗脱，70%乙醇溶液洗脱的洗脱速度为2BV/h，收集70%乙醇溶液洗脱的洗脱液，洗脱液减压浓缩后，喷雾干燥，得南瓜籽粕分子肽。喷雾干燥的通风温度为210℃，出风温度95℃，进料流量为30L/h。
实施例2
一种混合菌固态发酵南瓜籽饼粕制备南瓜籽粕分子肽的方法，包括如下步骤：
（1）乳酸菌发酵：把乳酸菌与已灭菌的米粉按照1: 6的重量比混匀得乳酸菌米粉混合物，将乳酸菌米粉混合物投入发酵培养基中混合均匀，乳酸菌米粉混合物用量为发酵培养基重量的15%，35-40℃发酵培养；所述发酵培养基按重量百分比计组成如下：南瓜籽饼粕粉（40-60目）70%，南瓜籽壳粉（20-40目）10%，水20%；pH自然，121℃、灭菌半小时，降温至35-40℃。乳酸菌的制作方法为：在500L水中加入70kg全脂奶粉及55kg蔗糖，加热搅拌溶解，115℃、0.1MPa下灭菌30-60min，冷却至42℃，然后加入10kg乳酸菌粉（市售）搅拌均匀，保持温度42℃小发酵培养8小时得酸奶状产物。
（2）黑曲霉发酵：当乳酸菌发酵培养至发酵培养基的pH降至4.5时，接入黑曲霉孢子粉，黑曲霉孢子粉用量为发酵培养基重量的18%，35℃发酵培养70小时得发酵产物，黑曲霉发酵培养前24小时的通空气量为4500m3/h，发酵培养25-49小时的通空气量为3500m3/h，在发酵培养至50h时，向发酵培养基中补加发酵培养基重量20%重量的营养液，同时控制通空气量为1100m3/h至发酵结束。
黑曲霉孢子粉的制作方法为： 将黑曲霉斜面菌种用无菌水洗出，制成黑曲霉孢子浓度为2×106个/mL的黑曲霉孢子悬液，把黑曲霉孢子悬液加至活化培养基中， 38℃培养24小时，然后和灭菌过的南瓜籽壳粉混合按照1: 2.5的重量比例混合得黑曲霉孢子粉。活化培养基的原料重量百分比组成为：麸皮56%、南瓜籽饼粕粉10%、NaH2PO42%、MgSO41%、NaNO30.5%、酵母膏0.5%、水30%，pH自然、121℃、灭菌半小时、降温至35-40℃。
营养液按重量百分比计的配方为：葡萄糖浓度3%，磷酸二氢钾1.6%，烟酸2.2‰，胆碱1.8‰，叶酸2.23‰，VB2 2.8‰，水余量。
（3）南瓜籽粕分子肽的提取分离：将发酵产物按1: 25的重量比与水混合， 60℃搅拌浸泡4小时，经板框压滤，滤液经截留分子质量10000道尔顿的中空纤维柱过滤截留，得超滤液，超滤液经减压浓缩，样品以2BV/h的流速上大孔树脂柱（大孔树脂D3520）吸附，然后以4BV/h流速，用20%乙醇溶液冲洗至流出液为无色时改用70%乙醇溶液洗脱，70%乙醇溶液洗脱的洗脱速度为2BV/h，收集70%乙醇溶液洗脱的洗脱液，洗脱液减压浓缩后，喷雾干燥，得南瓜籽粕分子肽。喷雾干燥的通风温度为210℃，出风温度95℃，进料流量为30L/h。
实施例3：
一种混合菌固态发酵南瓜籽饼粕制备南瓜籽粕分子肽的方法，包括如下步骤：
（1）乳酸菌发酵：把乳酸菌与已灭菌的米粉按照1:5的重量比混匀得乳酸菌米粉混合物，将乳酸菌米粉混合物投入发酵培养基中混合均匀，乳酸菌米粉混合物用量为发酵培养基重量的12%， 35-40℃发酵培养；所述发酵培养基按重量百分比计组成如下：南瓜籽饼粕粉（40-60目）70%，南瓜籽壳粉（20-40目）10%，水20%；pH自然，121℃、灭菌半小时，降温至35-40℃。乳酸菌的制作方法为：在500L水中加入60kg全脂奶粉及50kg蔗糖，加热搅拌溶解，115℃、0.1MPa下灭菌30-60min，冷却至40℃，然后加入8kg乳酸菌粉（市售）搅拌均匀，保持温度40℃小发酵培养10小时得酸奶状产物。
（2）黑曲霉发酵：当乳酸菌发酵培养至发酵培养基的pH降至4.8时，接入黑曲霉孢子粉，黑曲霉孢子粉用量为发酵培养基重量的15%，33℃发酵培养70小时得发酵产物，黑曲霉发酵培养前24小时的通空气量为4000m3/h，发酵培养25-49小时的通空气量为3000m3/h，在发酵培养至50h时，向发酵培养基中补加发酵培养基重量18%重量的营养液，同时控制通空气量为1000m3/h至发酵结束。
黑曲霉孢子粉的制作方法为： 将黑曲霉斜面菌种用无菌水洗出，制成黑曲霉孢子浓度为5×106个/mL的黑曲霉孢子悬液，把黑曲霉孢子悬液加至活化培养基中，36℃培养25小时，然后和灭菌过的南瓜籽壳粉混合按照1:2的重量比例混合得黑曲霉孢子粉。活化培养基的原料重量百分比组成为：麸皮56%、南瓜籽饼粕粉10%、NaH2PO42%、MgSO41%、NaNO30.5%、酵母膏0.5%、水30%，pH自然、121℃、灭菌半小时、降温至35-40℃。
营养液按重量百分比计的配方为：葡萄糖浓度3%，磷酸二氢钾1.6%，烟酸2.2‰，胆碱1.8‰，叶酸2.23‰，VB2 2.8‰，水余量。
（3）南瓜籽粕分子肽的提取分离：将发酵产物按1:22的重量比与水混合，58℃搅拌浸泡5小时，经板框压滤，滤液经截留分子质量10000道尔顿的中空纤维柱过滤截留，得超滤液，超滤液经减压浓缩，样品以2BV/h的流速上大孔树脂柱（大孔树脂D3520）吸附，然后以4BV/h流速，用20%乙醇溶液冲洗至流出液为无色时改用70%乙醇溶液洗脱，70%乙醇溶液洗脱的洗脱速度为2BV/h，收集70%乙醇溶液洗脱的洗脱液，洗脱液减压浓缩后，喷雾干燥，得南瓜籽粕分子肽。喷雾干燥的通风温度为210℃，出风温度95℃，进料流量为30L/h。
本发明的方法，南瓜籽粕分子肽的转化率达到75-85%，南瓜籽粕分子肽的含氮量在95%以上。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。