使用琼脂水解酶制备源自海藻的半乳糖的方法与流程

本申请要求于2015年7月1日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2015-0094302号优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。
技术领域：
本发明涉及一种通过海藻例如红藻残余物的酶促处理来制备半乳糖的方法。具体而言，制备半乳糖的方法包括：制备海藻残余物，用酶处理海藻残余物，以及使包含在海藻残余物中的半乳糖浓缩、沉淀并颗粒化。
背景技术：
：半乳糖是海洋藻类诸如红藻中的碳水化合物组分之一，并在应用于用于化学反应的原材料和生理活性物质的开发以及用于制药领域时时具有有用的功能。半乳糖是很少在自然界中见到游离形式但是广泛地以聚合物形式分布的己醛糖，且具有C6H12O6的分子式和约167℃的熔点。半乳糖可以制成易溶于水的有甜味的白色粉末，且当含有结晶水时可具有约118℃的熔点。半乳糖可以是D-和L-型的光学异构体，而D-半乳糖是普遍存在的半乳糖。当前对于作为生物糖的半乳糖制备的研究，集中在使用酸性材料的糖化技术，但是使用酸性材料的糖化技术还没有商业化。因为使用酸性材料的糖化技术需要使用酸性化学品，不利之处在于必须中和酸性化学品。此外，高浓度的酸材料已使红藻细胞壁的降解最大化，其可能回改变所产生的单糖生物糖的结构，从而导致副产物的产量增加。问题在于，糖化收率降低。此外，通过糖化方法制备的半乳糖是单糖，且半乳糖不能作为颗粒直接从糖化液体获得，是因为海藻组分的蛋白质和其他杂质以及酸 性化学品可能在酸性糖化时包含在液体中。然而，当前对于通过糖化过程由海藻制备生物糖诸如半乳糖的技术的研究集中在使用酸性化学品使海藻糖化、中和酸性化学品、且然后通过发酵过程制备燃料材料如生物乙醇的方法。直接地从糖化液体将单糖生物糖例如半乳糖制备为颗粒的技术还没有完成。此外，因为通过使用酸性化学品的糖化技术获得的糖化液体包含生物糖类，其利用方法已得以研究。然而，还没有令人满意的对于固相的酶促糖化的研究，其中该固相是作为使用酸性化学品的糖化作用而来的残余物而产生的。从约20年前就已经开始研究在从陆生植物资源制备糖类中所需的纤维素酶，且其商业产品已由世界上最大的制造商例如丹麦诺维信提供。然而，海藻半乳聚糖降解酶即琼脂水解酶的商业生产还未实现，且化学制备琼脂水解酶的技术和方法还未被开发。因此，对于酶促糖化作用的研究仍然处于非常初级的阶段。这种用于在使用酸性化学品的糖化作用后剩余的固相材料的酶促糖化技术可以有工业价值，且经济的酶制备、通过使用酶的糖化、以及分离与纯化技术有很高的工业重要性。然而，在世界范围还没有可用的在海藻糖化作用后使用酶类生产半乳糖的方法，且在实验室水平上也没有关于完整过程发展的报道。该技术仍然停留在通过分析糖化作用后的液体来报告存在于糖化液体中的糖组分的水平上。技术实现要素：为解决上述问题，本发明人已经研究了，能够使用酶类通过特定单元过程的组合从红藻残余物制备固相半乳糖颗粒，从而完成本发明。在一方面，本发明提供一种制备半乳糖的方法。该方法可以包括：通过包括红藻的糖化和过滤的步骤来制备红藻残余物；使红藻残余物与含琼脂水解酶的溶液反应，以获得糖混合物；过滤糖混合物；浓缩过滤的糖混合物；以及通过包括向浓缩的糖混合物添加醇的步骤来沉淀半乳糖。红藻可以是选自角叉菜属(Chondrus)、麒麟菜属(Eucheuma)、杉藻属(Gigartina)、鸡毛菜属(Pterocladia)、沙菜属(Hypnea)、Iridaea属、卡帕藻属(Kappaphycus)、石花菜属(Gellidium) 和江蓠属(Gracilaria)中的一种或多种。当制备红藻残余物时，糖化作用可以在约80～150℃的温度下进行。优选地，糖化作用可以是红藻的水解作用，且水解作用可以通过包括添加浓度为约0.1％(w/v)～15％(w/v)的酸的步骤进行。具体地，酸可以是选自硫酸(H2SO4)、盐酸(HCl)、氢溴酸(HBr)、硝酸(HNO3)、醋酸(CH3COOH)、甲酸(HCOOH)、高氯酸(HClO4)、磷酸(H3PO4)和对甲苯磺酸(PTSA)中的一种或多种。当制备红藻残余物时，红藻的过滤可以通过硅胶柱色谱法或使用过滤器的过滤来进行。琼脂水解酶可以从Saccharophagusdegradans2-40获得。优选地，含有琼脂水解酶的溶液可以通过包括培养Saccharophagusdegradans2-40；从培养基中取出Saccharophagusdegradans2-40；以及使留在培养基中的琼脂水解酶浓缩的步骤获得。具体地，Saccharophagusdegradans可以在温度约30～40℃下培养约36～72小时。糖混合物可以通过包括使用柱层析过滤糖混合物，且另外使用微孔过滤器过滤糖混合物的步骤进行过滤。柱层析可以包含平均粒径为约0.1～0.5mm的硅胶，且微孔过滤器可以具有约0.45～0.9μm的孔径大小。优选地，可以在约0.1～100mL/min的流量下进行糖混合物的过滤。过滤的糖混合物可以通过在真空下对过滤的糖混合物进行蒸馏而浓缩。优选地，可以在约30～60℃的温度、约10～120mbar的压力下进行浓缩。当沉淀半乳糖时，沉淀可以在约-10℃～25℃的温度下进行。优选地，在沉淀中添加的醇可以是选自甲醇、乙醇和丙醇中的一种或多种。制备半乳糖的方法还可以包括额外的沉淀后过滤，以获得半乳糖颗粒。在另一方面，本发明提供由本文所述方法制备的半乳糖。由此制备的半乳糖可以包括D-半乳糖、L-半乳糖或其混合物。此外，半乳糖可以是白色固体颗粒形式。优选地，半乳糖可以具有约163～170℃的熔点以及约80wt％或更高的纯度。本发明的其他方面在下文中公开。附图说明图1是示出根据本发明示例性实施方式的制备半乳糖的示例性方法的流程图；以及图2是根据本发明示例性实施方式的通过酶促处理获得的示例性半乳糖颗粒的照片。具体实施方式本文所用的术语仅出于描述具体的示例性实施方式的目的，而不意在限制本发明。本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“该”也意在包括复数形式，除非上下文清楚地指出其他意思。还应当理解，当在本说明书中使用时，术语“包括、包含”和/或“含有”指出所述特征、整数、步骤、操作、要素、和/或部件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、部件和/或其集合的存在或添加。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项的任何和所有组合。除非特别指出或从上下文清晰得到，本文使用的术语“约”应理解为在本领域的正常容忍范围内，例如在均值的2个标准差内。“约”可以理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非另外从上下文清晰得出，本文中提供的所有数值都被术语“约”修饰。在下文中，将具体解释根据各种示例性实施方式的用于从红藻或红藻残余物中制备半乳糖的树脂复合材料和方法。组成红藻细胞壁的多糖包括纤维素、木聚糖、甘露聚糖、琼脂和卡拉胶。例如，已知琼脂是构成红藻细胞壁外层和细胞间隙的粘性多糖的主要组分。琼脂是由半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖(AHG)作为单元组成的聚合物，其由α-1,3-键和β-1,4-键交替键合(KazlowskiB,PanCL,KoYT(2008),Separationandquantificationofneoagaroandagaro-oligosaccharideproductsgeneratedfromagarosedigestionbybetaagaraseandHClinliquidchromatographysystems.CarbohydrateResearch, 343,2443-2450)。经由α-1,3-键连接的3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的单元，称为新琼脂二糖(neoagarbiose)，已使用核磁共振法(NMR)分析，3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖(D-半乳糖)构成新琼脂二糖(KimHT,LeeS,LeeD等人(2009),OverexpressionandmolecularcharacterizationofAga50Dfromsaccharophagusdegradans2-40.Appliedmicrobiologyandbiotechnology,1432-0614(网上发布))。因为降解琼脂的海洋微生物例如Bacillusgelaticus最早由Gran在1902年分离出，已报道噬琼胶菌属(Agarivorans)、交替单胞菌属(Alteromonas)、噬胞菌属(Cytophaga)和产微球茎菌属(Microbulbifer)(SwartzMN,NancyG.(1958)，Agarasefromanagar-digestingbacterium.Journalofbacteriology,77,403-409)。其中，已知Saccharophagusdegradans2-40是能够降解许多复合多糖诸如琼脂糖的需氧棒状、γ-亚群的变形菌(EkborgNA,GonzalezJM等人(2005)，Saccharophagusdegradansgen.nov.,sp.Nov.,aversatilemarinedegraderofcomplexpolysaccharides，Internationaljournalofsystematicsandevolutionarymicrobiology,55,1545-1549.)。以前其被划分为产微球茎菌属，但在2005年正式命名为Saccharophagusdegradans2-40。菌株的基因组序列(美国能源部联合基因组研究所)在2008年被揭露(WeinerRM,TalyorLE,HenrissatB等人(2008)，Completegenomesequenceofthecomplexcarbohydrate-degradingmarinebacterium,Saccharophagusdegradansstrain2-40,PLOSGenetics,4,e1000087)。因此，在一个方面，本发明提供一种制备半乳糖的方法。如图1所示，该方法可以包括：通过包括红藻的糖化和过滤的步骤来制备红藻残余物；使红藻残余物与含有琼脂水解酶的溶液反应以获得糖混合物；过滤糖混合物；浓缩过滤的糖混合物；以及通过包括向浓缩的糖混合物添加醇的步骤来沉淀半乳糖。在示例性实施方式中，红藻的糖化作用可以在约80～150℃、约100～150℃或特别地约120～150℃的温度下进行，但不限于此。此外，糖化过程可以是红藻的水解，其中水解可以通过添加浓度为约0.05～15％(w/v)、约0.05～10％(w/v)、约0.05～5％(w/v)、约 0.1～15％(w/v)、约0.1～10％(w/v)、约0.1～5％(w/v)、约0.5～15％(w/v)、约0.5～10％(w/v)、约0.5～5％(w/v)、约1～15％(w/v)、约1～10％(w/v)、或特别地为约1～5％(w/v)的酸而进行，但不限于此。此外，酸可以是选自硫酸(H2SO4)、盐酸(HCl)、氢溴酸(HBr)、硝酸(HNO3)、醋酸(CH3COOH)、甲酸(HCOOH)、高氯酸(HClO4)、磷酸(H3PO4)和对甲苯磺酸(PTSA)中的一种或多种，但不限于此。此外，红藻可以包含或生产半乳糖或其聚合物。具体地，红藻可以属于角叉菜属、麒麟菜属、杉藻属、鸡毛菜属、沙菜属、Iridaea属、卡帕藻属、石花菜属或江蓠属。例如，可以使用例如江蓠属或石花菜属(琼脂)的红藻，但不限于此。此外，红藻可以提供为原料红藻的干燥产物、洗涤原料红藻后的干燥产物、或其粉末，但不限于此。此外，用于制备红藻残余物的过滤可以至少使用柱层析或使用过滤器进行，但不限于此。本领域通常使用的任何过滤器都可以使用而没有限制。具体地，柱层析可以包含硅胶或二氧化硅树脂。硅胶可以是具有约0.1～0.5mm、约0.1～0.4mm、约0.1～0.3mm、或特别地为约0.1～0.2mm的平均粒径的颗粒形式。硅胶可以是可以使用的各种中性硅胶，但硅胶不限于特定的二氧化硅材料。过滤器可以具有约1～20μm、约1～15μm、约1～10μm、约3～20μm、约3～15μm、约3～10μm、约5～20μm、约5～15μm、或特别地为约5～10μm的孔径大小，但不限于此。由此制备的红藻残余物可以作为过滤后剩余的固体而获得。红藻残余物可以接着与含有琼脂水解酶的溶液反应，以获得可包含在红藻细胞壁产生的半乳糖的糖混合物。糖混合物可以是液体，例如水溶液。与使用酸性材料和其他化学品的糖化技术相比，通过酶促处理例如琼脂水解酶获得包含半乳糖的糖混合物的方法，可以大大降低生产成本。例如，使用酶促处理的方法不需要对使用酸性材料的糖化过程中注入的酸性材料进行中和。此外，该方法还可以改善在浓缩过程中的操作稳定性和效率。反应可以在约30～70℃、约30～60℃、约40～70℃、约40～60℃、或特别地约50℃的反应温度下进行，但不限于此。此外，反应可以进行约48小时或更长，例如约48～96小时、约48～84小时、约48～72小时、或特别地为约48～60小时的反应时间，但不限于此。琼脂水解酶可以由包含微生物或菌株的培养物获得，通过包括培养能够产生琼脂水解酶的菌株，以及从培养基除去菌株的步骤而生产。琼脂水解酶可以从诸如芽孢杆菌属(Bacillus)、噬琼胶菌属、交替单胞菌属、噬胞菌属、产微球茎菌属、Saccharophagus属等的菌株获得或生产，且例如琼脂水解酶可以由Saccharophagusdegradans2-40生产。菌株可以在约30～40℃、约33～40℃、约35～40℃、或特别地在约37℃的温度下培养36～72小时、36～66小时、36～60小时、36～52小时、42～72小时、42～66小时、42～60小时、42～52小时或48小时，以适当地或大量地生产琼脂水解酶，但培养条件可以不限于此。此外，在上述菌株中生产琼脂水解酶的培养基可以通过向1L水中添加约2.3％的人工海水、约0.5％的氯化铵、1.5％的琼脂和50mM的Tris-HCl而制备。人工海水可以制备成具有与35‰盐度的海水相同的化学组成。例如，人工海水可以通过混合溶液1与溶液2而制备，其中溶液1通过在500ml蒸馏水中溶解约23.9g的NaCl、约4.0g的Na2SO4、约0.7g的NaHCO3、约0.1g的KBr、约30mg的H3BO3和约3mg的NaF而制备，溶液2通过在455ml蒸馏水中溶解约10.8g的MgCl2·6H2O、约1.5g的CaCl·2H2O和约25mg的SrCl2·6H2O而制备。过滤可以包括使用硅胶柱层析的初次过滤，以及在初次过滤步骤后使用微孔过滤器的二次过滤。初次过滤可以使用硅胶柱层析进行一个或多个循环，例如1～10个循环、1～5个循环、或1～3个循环。具体地，硅胶柱层析可以除去糖混合物中的杂质，诸如任何颗粒和蛋白质组分。此外，硅胶颗粒可以具有约0.1～0.5mm、约0.1～0.4mm、约0.1～0.3mm或约0.1～0.2mm的平均粒径，且可以使用各种中性硅胶，但硅胶不限于特定的二氧化硅材料。此外，填充在硅胶柱中的硅胶体积相对于注入的糖混合物体积可以合适地为1/2～1/5。如果体积比超出该范围， 分离效率会降低或杂质颗粒的量会增加，从而生成在最终的颗粒化过程中硅胶颗粒可能与半乳糖颗粒共存的问题。此外，在二次过滤中使用的微孔过滤器可以具有约0.45～0.9μm的孔径大小。当使用具有0.45μm或更小孔径的过滤器时，过滤过程的操作稳定性会降低，导致不经济的过程。当使用具有大于0.9μm孔径的过滤器时，一些微颗粒无法过滤，从而降低最终产物的纯度。糖混合物在柱层析中的流量可以为约0.1～100mL/min、约0.1～约80mL/min、约0.1～约60mL/min、约0.1～约40mL/min、约0.1～20mL/min、约0.1～10mL/min、约0.1～5mL/min或特别地为约3.5mL/min，但不限于此。适合于大规模系统的流量可以适当地调整。过滤后的糖混合物，例如经过初次和二次过滤的糖混合物，可以进行浓缩。例如，糖混合物可以通过真空下蒸馏而浓缩以除去水或其他溶剂，使用真空蒸馏装置，但不限于特定的装置。优选地，糖混合物可以浓缩到过滤糖混合物体积的约1/10～1/20。此外，糖混合物的浓缩可以在约30～60℃的温度下进行。当温度高于约60℃时，要浓缩的半乳糖会发生部分脱色。当温度低于30℃时，操作时间会增加。此外，浓缩可以在约10～120mbar的压力下进行。当压力大于120mbar时，操作时间会增加。当压力为10mbar或更小时，过程稳定性会降低。可以从浓缩的糖混合物中沉淀半乳糖。具体地，醇可以添加到浓缩的糖混合物中以引发半乳糖颗粒的形成(颗粒化)，从而沉淀半乳糖。沉淀可以在约-10℃～25℃的温度下进行，或者可选地，温度为约-10℃～25℃的醇可以添加到浓缩的糖混合物中。沉淀的半乳糖固体颗粒可以使用真空过滤设备获得。醇可以是选自具有1～4个碳原子的直链或支链醇中的一种或多种，例如甲醇、乙醇和丙醇(如异丙醇)，但不限于此。醇的浓度可以为约10～100％(v/v)、约20～100％(v/v)、约30～100％(v/v)、约40～100％(v/v)、约50～100％(v/v)、约60～100％(v/v)、约70～100％(v/v)、约80～100％(v/v)、约90～100％(v/v)、约95～100％(v/v)、或约98～100％(v/v)，例如约99％(v/v)。在特定实施方式中， 醇可以是浓度为约10～100％(v/v)、约20～100％(v/v)、约30～100％(v/v)、约40～100％(v/v)、约50～100％(v/v)、约60～100％(v/v)、约70～100％(v/v)、约80～100％(v/v)、约90～100％(v/v)、约95～100％(v/v)、或约98～100％(v/v)的醇，例如99％(v/v)的甲醇、乙醇和丙醇(如异丙醇)。醇的注入体积可以适当地为浓缩糖混合物体积的约5～10倍。当体积为约5倍或更少时，颗粒的沉淀不能适当地发生。当体积为约10倍或更多时，过量使用会使成本增加。通过制备半乳糖的方法而制备的半乳糖可以包括D-半乳糖、L-半乳糖或其混合物。此外，半乳糖可以以白色固体颗粒或粉末的形式获得。如果半乳糖以固体颗粒形式获得，当半乳糖用作其他化学反应的起始材料时，具有易于称重、注入量的精确控制、易于存储以及体积减小的优点。如果将液相半乳糖用作随后化学反应的起始材料，上述优点无法预期，因此，生产过程会变得非常困难。另一方面提供一种通过制备半乳糖的方法而制备的半乳糖。通过制备半乳糖方法而制备的半乳糖可以包括D-半乳糖、L-半乳糖或其混合物。此外，半乳糖可以是白色固体颗粒的形式，但不限于此。此外，半乳糖可以具有约163～170℃的熔点，例如约167～169℃。考虑到纯的半乳糖具有约167～169℃的熔点，半乳糖可以是具有纯度为约80wt％或更高、85wt％或更高、90wt％或更高、95wt％或更高、96wt％或更高、97wt％或更高、98wt％或更高、或99wt％或更高的半乳糖。本发明涉及一种通过红藻残留物的酶促处理来制备半乳糖的方法。具体地，制备半乳糖的方法可以包括制备残余物，使残余物与酶反应，浓缩所制备的糖混合物，以及使包含在糖混合物中的半乳糖沉淀并颗粒化。根据本发明的制备方法表明提出以高收率获得半乳糖的重要工业技术，例如，不是通过丢弃从使用酸性化学品的传统糖化方法中获得的各种固体材料，而是通过用酶处理它们。此外，该方法为培养红藻的渔村提供了经济利益，并解决了由海藻无人管理引起的环境问题。在下文中，本发明将参考以下实施例进行更详细的描述。然而，这些实施例仅用于示例说明的目的，且本发明的范围不意在由这些实施例进行限制。实施例制备例：含有琼脂水解酶的溶液的制备培养海洋菌株Saccharophagusdegradans2-10(可从美国弗吉尼亚州马纳萨斯的ATCC(美国模式培养物保藏中心)得到)。具体而言，培养基组成为在1L水中的2.3％的人工海水(产品名称：AquariumSystems,Mentor,Ohio)、0.5％的氯化铵(Sigma-Aldrich公司)、50mM的Tris-HCl(Sigma-Aldrich公司)和1.5％的琼脂(Sigma-Aldrich公司)，且培养在5L-发酵反应器中于温度35℃的条件下进行48小时。培养物在6000rpm下离心(Continent512R，HanilScienceIndustrialCo.)30分钟，从而获得1000ml包含得自Saccharophagusdegradans2-40的琼脂水解酶的液体上清液。实施例1：制备源自红藻的半乳糖步骤1：制备红藻残余物将在韩国Chunnam沿海地区收集的江蓠属红藻干燥并粉碎。然后，将350mL的蒸馏水和150mL的1NHCl溶液添加到500cc烧瓶中，且将该溶液调节到0.3NHCl。将由此干燥并粉碎的25g江蓠添加到溶液中，接着在120℃下震摇4小时。接着，在停止震摇后，将溶液静置在室温下(25℃)，并使用填充有二氧化硅颗粒的柱过滤，以获得15g红藻残余物。步骤2：获得含有半乳糖的糖混合物将在制备例中制备的10mL含有琼脂水解酶的溶液，相对于在步骤1中获得的1g红藻残余物进行混合。混合后，使溶液在50℃下反应48小时，获得200cc的含有半乳糖的糖混合物。步骤3：过滤初次过滤步骤通过将糖混合物以3.5mL/min的流量施加到填充有平均直径为0.1～0.5mm的100mL中性硅胶颗粒的柱中。接着，使流经硅胶柱的液体材料使用平均孔径为0.45μm的微孔过滤器进行二次 过滤。通过这些过滤程序，得到已除去固相材料的150ml液体糖混合物。步骤4：浓缩和颗粒化(沉淀)在水浴温度55℃和90mbar低压下，使用旋转蒸发仪(RV10)来将液体糖混合物浓缩至浓缩前体积的约1/20。然后，将低温下存储的99％(v/v)乙醇添加到浓缩后的材料中，以沉淀颗粒。关于这方面，注入乙醇的体积是浓缩后材料的约20倍。之后，沉淀的颗粒进行真空过滤，以获得10g半乳糖颗粒。获得的半乳糖颗粒如图2所示。比较例1以与实施例1相同的方式进行制备，除步骤2使用市售酶纤维素酶(Viscozyme；Novozyme)代替在制备例中制备的含有琼脂水解酶的溶液外。比较例2以与实施例1相同的方式进行制备，除进行浓缩和颗粒化步骤而无过滤步骤外。比较例3以与实施例1相同的方式进行制备，除在过滤步骤中进行硅胶柱层析而不进行微孔过滤，并然后进行浓缩和颗粒化步骤外。比较例4以与实施例1相同的方式进行制备，除在浓缩后的颗粒化步骤中用99％(v/v)的己烷代替乙醇外。在这一点上，注入的己烷的体积是浓缩后材料体积的约20倍。比较例5是以与实施例1相同的方式进行制备，除在浓缩后的颗粒化步骤中用99％(v/v)的乙酸乙酯代替乙醇外。在这一点上，注入的乙酸乙酯的体积是浓缩后材料体积的约20倍。实验例1：半乳糖颗粒形成的测试检测实施例1和比较例1～5的半乳糖颗粒的形成。结果在下列表1中给出。[表1]分类颗粒形成实施例1颗粒比较例1粘性物质/无颗粒比较例2粘性物质/无颗粒比较例3粘性物质/无颗粒比较例4粘性物质/无颗粒比较例5粘性物质/无颗粒如表1所示，在实施例1中形成颗粒，而比较例1～5中仅生成粘性物质且无颗粒形成。实验例2：用于半乳糖形成测试的熔点测量为考察实施例1和比较例1～5是否生成半乳糖，使用差示扫描量热仪(DSC)(美国，TAinstruments)测量指示其纯度的熔点。具体而言，半乳糖试剂的熔点测量为167～169℃。测量实施例1和比较例1～5的熔点，且结果在下列表2中给出。[表2]熔点(℃)实施例1167比较例165比较例266比较例350比较例445比较例545如表2所示，发现实施例1具有167℃的熔点，其在半乳糖试剂的167～169℃熔点范围内，表明产生了半乳糖。相比之下，发现比较例1～5具有45～65℃的熔点，其不在半乳糖试剂的熔点范围内，表明没有产生半乳糖。当前第1页1 2 3