一种灰略红链霉菌果胶酯酶及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程和现代酶工程技术领域，涉及一种灰略红链霉菌果胶酯酶及其编码基因和应用，具体涉及一种果胶酯酶及其编码基因序列、含有该编码基因序列的重组表达载体和转基因重组菌以及该果胶酯酶的应用。

背景技术：

果胶酶是广泛存在于果实及多种微生物中，是一类可以作用于果胶质的一类由许多单酶组成的复合酶的总称。果胶酶在苎麻脱胶、木材防腐和酒精发酵等领域具有主要的应用意义，目前已广泛应用于食品行业。

果胶酯酶(EC 3.1.1.11)是一种能催化、水解果胶生产果胶酸和甲醇的酶。果胶酶对聚半乳糖醛酸甲酯具有高度的专一性，无法催化聚甘露糖醛酸甲酯，但是能够水解聚半乳糖醛酸乙酯、丙酯和烯丙酯，但是水解速度较甲酯低。果胶酯酶能够从果胶分子的还原性末端或其临近的游离羧基开始进攻去甲氧基，沿着分子以单链机制进行，形成对二价阳离子非常敏感的游离态半乳糖醛酸区域。目前，果胶酯酶在食品行业中应用较多，常用于制备低甲氧基果胶及果汁澄清加工。因此，果胶酯酶有着广泛的用途和开发前景，目前新型果胶酯酶的开发和制备已经成为研究的热点。

果胶酯酶来源广泛，细菌、真菌和放线菌都能产生果胶酯酶，但是能产生果胶酯酶并成功应用于工业生产的实例却还很少。研究表明，链霉菌是合成果胶酯酶的理想菌株。本发明针对克隆自灰略红链霉菌的新型果胶酯酶，经密码子优化后对其进行原核表达分析及初步酶学性质分析，为该果胶酯酶的异源重组表达及生产利用提供了有效的途径。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种灰略红链霉菌果胶酯酶。

本发明的另一目的在于提供一种果胶酯酶的编码基因。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述的果胶酯酶编码基因的重组表达载体或转基因重组菌。

本发明的另一目的在于提供一种上述的果胶酯酶编码基因在表达果胶酯酶中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种上述的果胶酯酶在水解果胶中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

一种灰略红链霉菌果胶酯酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

本发明提供的果胶酯酶及其编码基因克隆自灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)，命名为JSD-1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期：2012.01.09，保藏编号为CGMCC No.5706，具有下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

(2)所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1经密码子优化后得到的SEQ ID NO.2的核苷酸序列；

(3)编码序列表中的SEQ ID NO.3氨基酸序列的多核苷酸。

本发明所述的果胶酯酶基因序列是通过全基因组测序、密码子优化及全基因人工合成的方式获得。本发明涉及的实验技术包括灰略红链霉菌基因组及大肠杆菌质粒DNA的提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶回收、连接、质粒酶切、转化、蛋白诱导表达及纯化、聚丙烯酰胺凝胶电泳及重组果胶酯酶活性的测定等，具体步骤为：以灰略红链霉菌基因组为模板，通过密码子优化及基因人工合成的方式获得该基因序列，随后将该基因序列连接到表达载体pET-22b(+)上，并将重组质粒转入到特定的大肠杆菌表达菌株TransB(DE3)内，进而获得果胶酯酶表达菌株，最终通过IPTG诱导实现果胶酯酶的体外高效表达，最后收集菌体、细胞破碎，离心后获得粗酶液，之后进行蛋白纯化并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot检测表达情况，最后测定该果胶酯酶相关的酶学特征。

从灰略红链霉菌得到的果胶酯酶具有以下特征：

1.该果胶酯酶的编码基因共有1101个核苷酸，序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，共编码366个氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示。

2.该果胶酯酶的适合反应温度为45～65℃，优选为55℃。

3.该果胶酯酶的适合反应的pH为7～10，优选为8。

4.除Hg²⁺之外，Cu²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺及Fe²⁺对该酶活性影响较小，对重金属离子有较普遍的耐受能力；酶活性抑制剂DTT和SDS对该酶活性抑制率分别为13.7％和17.0％，而EDTA对该酶活性抑制较为明显，酶活抑制程度可达37.5％。

所述的果胶酯酶编码基因的重组表达载体及转基因重组菌。所述的重组表达载体为将上述的果胶酯酶的编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达果胶酯酶的重组表达载体，所述的大肠杆菌重组表达载体为pET-22b(+)载体。

所述的转基因重组菌为将上述的重组表达载体导入到大肠杆菌中，筛选得到表达果胶酯酶的转基因重组菌，所述的大肠杆菌为TransB(DE3)。

上述的果胶酯酶编码基因在表达果胶酯酶中的应用。

上述的果胶酯酶及其编码基因在水解果胶中的应用。

一种表达果胶酯酶的方法，是培养上述的转基因重组菌得到果胶酯酶。

本发明所述的果胶酯酶在天然灰略红链霉菌内的表达量和酶活性均较低，因此严重限制了其使用范围和效果。本发明利用基因工程手段，构建了果胶酯酶表达工程菌株，大幅度提高了目的蛋白果胶酯酶的表达量，为该果胶酯酶的高效表达与应用奠定了基础，可用于果胶的水解。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

第一.本发明通过构建外源表达载体，实现了上述果胶酯酶的体外高效表达，并通过对目的蛋白添加可溶性标签His₆·Tag和目的蛋白的周外空间表达，保证了蛋白生物活性的同时便于后续蛋白的纯化；

第二.本发明的果胶酯酶是一种碱性(最适反应pH约为8.0)、耐高温型(最适反应温度约为55℃)的裂解酶，该酶对多种重金属离子(如Hg²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺及Zn²⁺)及酶活性抑制剂(如EDTA、DTT、SDS)具有很强的耐受能力，这可降低酶在生产过程中对水和蛋白原料的纯度要求，避免了生产过程中的金属离子对酶活性的影响，提高了实际应用时的稳定性；

第三.本发明通过应用基因工程技术手段，实现果胶酯酶在体外的高效表达，克服现有技术中果胶酯酶在生物体内多为胞内表达，致使酶表达量和活性较低而导致的应用范围和效果严重受限的问题。

附图说明

图1为本发明的灰略红链霉菌的基因组电泳图；

图2为本发明的果胶酯酶信号肽切除位点的预测图；

图3为本发明的果胶酯酶的基因序列片段PCR扩增图；

图4为本发明的果胶酯酶外源诱导表达的示意图；

图5为pH对果胶酯酶活力影响的示意图；

图6为温度对果胶酯酶活力影响的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

为了更好的说明本发明，下方结合附图对本发明进行详细的描述。

1、灰略红链霉菌的基因组提取和测序

将灰略红链霉菌孢子悬浮液接种于LB液体培养基中，于37℃、150rpm 条件下培养3天，然后收集2.0mL菌液，12000rpm离心2min，并弃上清液，收集菌体沉淀，加入180μL溶菌酶(20mg/mL)和20μl EDTA溶液(0.5M,pH 8.0)，37℃处理45min，加入4μL RNase A(100mg/mL)，震荡混匀15s，室温放置5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒操作说明完成剩余操作，得到高纯度基因组DNA，最后通过0.8％琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，确保无明显RNA条带，基因组条带清晰、完整、无降解、无污染，如图1所示。

采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度的文库，采用Illumina Miseq(2×250bp)平台进行测序，收集测序的原始数据，对带接头、低质量的数据进行过滤，随后采用Newbler version 2.8对去除接头的测序数据进行从头拼接，构建Contigs及Scaffolds，最后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。

2、果胶酯酶的切割位点预测

基于基因功能注释，在该菌株基因组获得果胶酯酶编码基因。采用SignalP 4.1分别对果胶酯酶氨基酸序列进行信号肽模拟预测，如图2所示。结果表明果胶酯酶N端存在明显的信号肽序列，推测该酶为胞外酶，且信号肽切割位点位于第30位丙氨酸与第31位组氨酸之间。

3、果胶酯酶的基因序列密码子优化

采用JCat对该果胶酯酶基因序列进行密码子优化，以减少其密码子中GC含量、存在的茎环结构，同时在优化后基因序列中要避免出现转录终止位点和转录起始位点。经优化，基因GC含量由74.7％降为70.7％，且基因的密码子使用率由0.28提高至0.63。因此，以优化后的基因序列为模板，进行基因人工合成。

4、果胶酯酶表达载体构建

根据果胶酯酶基因序列，设计含有酶切位点的引物，序列如下：

PE-Nde I-F：

GGAATTCCATATGGTGGCAGCAGGCAAGCCGGCGATGCC

PE-EcoR I-R：

GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTGCACGCGGACGCCAGTCGCCCAGCC

以人工合成基因序列为模板，用含有Nde I和EcoR I酶切位点引物进行PCR扩增获得果胶酯酶基因序列，如图3所示，使用DNA A-Tailing Kit加A后连接到PMD^TM 19-T，并将连接产物转入DH5α大肠杆菌内。挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。Nde I和EcoR I进行双酶切(37℃)，回收果胶酯酶基因片段PE。用相同内切酶酶切表达载体pET-22b(+)并回收载体DNA片段。将果胶酯酶基因片段与载体片段混合，T4DNA连接酶过夜连接(16℃)，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板及菌落PCR筛选含有目的基因表达载体的阳性克隆。挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，180rpm、37℃培养16小时后提取质粒。

上述PCR扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，68℃延伸30s；30个循环后68℃终延伸3min。

5、果胶酯酶过表达菌株的构建

将果胶酯酶表达载体转入TransB(DE3)大肠杆菌，在含有氨苄青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(25μg/mL)及四环素(10μg/mL)的LB固体培养基上筛选，获得果胶酯酶过表达菌株。

上述的TransB(DE3)具有以下特征：该菌株具有卡那霉素(Kan^R)和四环素(Tet^R)抗性，此外该菌株还包含突变的硫氧还蛋白还原酶(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)基因，表达主要还原途径的两个关键酶。有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。

6、重组果胶酯酶体外过表达与纯化

挑取阳性克隆于含有氨苄青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(25μg/mL)及四环素(10μg/mL)的LB液体培养基中，在25℃震荡培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入IPTG溶液使其在发酵液中的浓度分别达到25-40μM，22℃继续培养20h进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓 冲液洗涤菌体一次，再利用1/10发酵液体积的磷酸盐缓冲液缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波破胞至菌液澄清，13000rpm离心15min收集上清，上清液即为果胶酯酶的粗酶液。收集上清液，经0.45μm醋酸纤维素膜过滤，之后通过Ni-NTA Resin与His₆·Tag间的亲和吸附进行蛋白纯化，并使用一定浓度的咪唑洗脱液对蛋白进行洗脱。

7、重组果胶酯酶表达验证

制备12％SDS-PAGE胶，将粗酶液与5×SDS-PAGE Loading Buffer比例混合，与沸水浴5min，每个点样孔上样20μL，在160V电压下电泳60-70min，直至溴酚蓝指示条带完全跑出胶。停止电泳，用考马斯亮蓝R-250溶液染色20min，然后用脱色液进行洗涤，直至背景色完全脱去，条带清晰可见。结果显示，经优化已经成功表达出明显的果胶酯酶条带，且浓度为50-150mM的咪唑洗脱液洗脱效果最佳。

按顺序组装转膜装置：正电极、海绵、三张滤纸、PVDF膜、SDS-PAGE胶、三张滤纸、海绵和负电极。其中PVDF膜使用前先用甲醇泡10min，滤纸用电转液浸泡。将装好的转膜装置放入电转槽，4℃、100V运行60-70min；将转好的PVDF膜置于封闭液中，并置于水平振荡器上室温封闭1h；将封闭完的PVDF膜转入一抗溶液中，置于滚动摇床37℃、150rpm孵育1h；随后转移一抗孵育后的PVDF至TBST缓冲液中，在摇床上震荡清洗3次，每次10min；之后再在TBS缓冲液中清洗1次，10min；将冲洗干净的PVDF膜放入二抗溶液中，置于滚动摇床37℃、150rpm孵育1h；洗膜，将染色液均匀涂抹于PVDF膜上，静置1min；通保鲜膜包好PVDF膜，置于X-光片盒中，并用透明胶带固定；于暗室中压片洗膜显影，结果如图4所示。

8、重组果胶酯酶酶学特征的测定

果胶酯酶催化水解果胶分子而释放出H⁺，使反应体系的pH下降，用碱液(0.05mol/L NaOH溶液)使反应体系的pH维持不变。通过碱的消耗量可以反应出果胶酯酶的活性。取30mL 1.0％的果胶溶液于100mL三角烧瓶中，加入10mL粗酶液，记录pH读数。同时开始记时，通过自动电位滴定仪用0.05M NaOH滴定，保持溶液的pH读数不变。以消耗的NaOH微摩尔数-反应时间 作图，由所得曲线最初部分的斜率表示果胶酯酶的活力，活力单位为mol/s，即每秒钟消耗1mol NaOH定义为一个活力单位。

采用上述方法测定在不同温度(30℃-70℃)、pH值(3.0-11.0)、1mM金属离子(Hg²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺及Zn²⁺)及1mM酶活性抑制剂(DTT、EDTA、SDS)处理1h后，果胶酯酶的残存活性，测定结果如图5和图6所示，随着温度升高，果胶酯酶活性呈的现先升高后降低的趋势，当温度为55℃时，该果胶酯酶具有最高的催化活性，同时该酶最适反应pH约为8.0。因此，该果胶酯酶的具有较强的耐高温能力和在碱性环境下具有较高的酶学活性。

该果胶酯酶对重金属离子有较普遍的耐受能力，如表一所示，除Hg²⁺之外，其余重金属离子如Cu²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺及Fe²⁺对该酶活性影响较小，Hg²⁺对该果胶酯酶的抑制作用较为显著，酶活性抑制率可达46.4％。

最后，酶活性抑制剂DTT和SDS对该果胶酯酶活性抑制率分别为13.7％和17.0％，而EDTA对该酶活性抑制较为明显，酶活抑制程度可达37.5％。

附表一重金属离子对果胶酯酶活性的影响

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这 些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。