一种鉴别黑鲷及黑鲷真鲷反交子代的方法与流程

本发明属于黑鲷鉴别领域，特别涉及一种鉴别黑鲷及黑鲷真鲷反交子代的方法。
背景技术：
：黑鲷(Acanthopagrusschlegelii)又称黑棘鲷，具有肉质细腻、营养丰富、适应性好、抗病能力强的特点，具有较高的营养和经济价值。但由于其生长速度较慢，在整个养殖周期内一般要经历两次越冬，养殖成本居高不下，限制了黑鲷养殖业的发展。近年来，江苏省海洋水产研究所通过与真鲷杂交的方式对其进行遗传改良，获得了两种性状优良的正交(真鲷(♀)×黑鲷(♂))和反交(黑鲷(♀)×真鲷(♂))子代，具有较好的养殖前景。正交子代的形态结合了双亲的特点，体型与真鲷一致，颜色和花纹则更接近于黑鲷，从外观上比较容易与亲本区分开来；反交子代在外观上与黑鲷则几乎完全一致，基于形态参数对二者进行鉴别的方法在实际操作中也存在着一定误差，这为养殖和育种管理工作带来不便。经过两年的养殖，反交子代已经性成熟，并有可能成为一种新的重要育种材料，这就为反交子代与黑鲷的鉴别提出了更高的要求，而分子方法则是目前最为可靠的鉴别手段。采用分子方法进行鉴别的第一步通常是鉴别对象基因组DNA的提取，目前最常用的DNA提取方式是酚/氯仿抽提法，该方法操作繁琐，耗时长，且提取试剂多具毒性。而试剂盒提取的成本则较高，不适合大量鉴别操作。物种的分子鉴别一般对DNA的要求不高，且所提DNA通常仅使用一次即被丢弃，因此，一种简便、快速、低成本的DNA提取方式将为鉴别工作提供极大便利。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴别黑鲷及黑鲷真鲷反交子代的方法，该方法鉴别准确、简单快速、价格低廉、对仪器设备要求低，适合大规模鉴别操作，具有良好的应用前景。本发明的一种鉴别黑鲷及黑鲷真鲷反交子代的方法，包括：(1)提取黑鲷及黑鲷真鲷反交子代样品的基因组DNA；(2)采用特异性引物进行PCR扩增；其中，引物序列为：5’-GCTGAACTGAGGTGGCTGAT-3'；5’-AGCTTGAGCAGGACTGAACC-3'；(3)PCR扩增产物经凝胶电泳后拍照记录比对电泳结果，黑鲷真鲷反交子代在215bp处有一条特异性条带，黑鲷在215bp处无特异性条带。所述步骤(1)中的样品为新鲜鳍条样品或无水乙醇保存样品。所述步骤(1)中的提取采用组成为1％TritonX-100和pH＝8.0、100mMTris-HCl的提取缓冲液。所述步骤(2)中的PCR扩增体系为：1.5μL10×PCRbuffer，0.5μLdNTP，1.0μLMg2+，1.5μLDNA提取液，上下游引物各0.5μL，0.2μLTaqDNA聚合酶，用灭菌双蒸馏水补足体积。所述步骤(2)中的PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃45s，52℃退火45s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。所述步骤(3)中凝胶电泳为2％琼脂糖凝胶电泳或8％聚丙烯酰胺凝胶电泳。本发明是基于分子生物学技术原理建立的鉴别方法。该方法无需依赖专业的分类学背景，也不要求具有长期从事鱼类鉴别的丰富经验；无需高级的荧光定量等实施操作仪器，只需要简单的分子生物学仪器就可以进行操作，具有准确快捷、经济实用的特点。有益效果(1)本发明克服了形态学特征无法准确鉴别黑鲷及黑鲷(♀)×真鲷(♂)杂交子代的不足，在遗传育种工作中具有重要意义；(2)本发明根据微卫星引物对DNA模板要求相对较低的特点，采用了一种可快速提取基因组DNA的简易方法，大大提高了鉴别效率；(3)本发明鉴别准确、简单快速、价格低廉、对仪器设备要求低，适合大规模鉴别操作，具有良好的应用前景。附图说明图1为真鲷、黑鲷及正、反交子代的外观对比图；图2为黑鲷及反交子代的电泳图片；其中，M为50bpDNAladder，1-8为黑鲷，9-16为反交子代，反交子代在215bp附近有一条清晰的特异性鉴别条带。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1(1)取20μg黑鲷及黑鲷(♀)×真鲷(♂)杂交子代鳍条样品于1.5mL离心管中，用玻璃研磨棒将样品在管壁充分研磨；加入200μL提取缓冲液(1％TritonX-100和100mMTris-Hcl(pH＝8.0))，震荡1min充分混匀；恒温水浴锅65℃放置30min，期间间或混匀；取出样品，冷却，静置5min，上清即为DNA提取液；(2)采用特异性引物进行PCR扩增；其中，引物序列为：5’-GCTGAACTGAGGTGGCTGAT-3'；5’-AGCTTGAGCAGGACTGAACC-3'；PCR扩增体系为：1.5μL10×PCRbuffer，0.5μLdNTP(10mmol/L)，1.0μLMg2+(25mmol/L)，1.5μLDNA提取液，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，0.2μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)，用灭菌双蒸馏水补足体积。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃45s，52℃退火45s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。(3)PCR扩增产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳显色后拍照记录比对电泳结果，黑鲷真鲷反交子代在215bp附近有一条清晰的特异性鉴别条带，黑鲷在215bp处无特异性条带，如图2所示。以某黑鲷及黑鲷真鲷反交子代养殖池塘为例，任取30条鱼分别采用上述方法以及人工形态学观察鉴别，结果如下表：黑鲷黑鲷真鲷反交子代准确率标准1812/本实施例1812100％形态参数鉴别151583.3％由此可见，本发明相较于形态参数鉴别法可以保证100％的鉴别准确率，判断快速，具有良好的实用价值。当前第1页1 2 3