本发明涉及生物技术应用领域，尤其应用于胶基型烟草制品对于人口腔微生物体外影响的测定。
背景技术：
胶基型无烟气烟草制品(Tobacco chewing gum)是一种在胶基中加入了一定量的烟草提取物、香料以及其他一些食用添加剂制成的一种口用无烟气烟草制品。胶基型烟草制品的使用方式是放入口中咀嚼，咀嚼的溶出物会与唾液汇合聚集在口腔中，根据消费习惯的不同吐出或者咽下。由于该产品主要作用于口腔，直接与口腔进行接触，对人口腔微生物具有直接影响，因此有必要建立一种检测其对人口腔微生物体外影响的方法，以对其生物学功能进行评估。
现有的烟草制品生物学测试方法主要是针对传统卷烟，通常是对传统卷烟的烟气进行捕集再进行后续的生物学测试。但是胶基型烟草制品并不产生烟气，且直接作用于口腔，因此传统卷烟的生物学测试方法并不适用于该产品。而袋装口含烟制品一般采用贴在牙龈与唇部之间的方式使用，其内含物采用普通浸泡法即可溶出，胶基型烟草制品由于胶基的存在，直接浸泡法大部分内含物难以溶出，从而无法准确进行生物学功能测试。
技术实现要素：
本发明针对胶基型产品的特点，结合生物学检测方法，建立了一种检测胶基型烟草制品对人口腔微生物体外影响的方法，为胶基型烟草制品的生物学功能测试提供参考。
本发明公开一种检测胶基型烟草制品对人口腔微生物体外影响的方法，包括以下步骤：
(1)将待测的所述胶基型烟草制品置于液氮中冷冻20-40min；
(2)将步骤(1)冷冻的所述胶基型烟草制品，立即用粉碎机将其粉碎，收集粉碎后的碎末胶基型烟草制品；
(3)再次将所述碎末胶基型烟草制品置于液氮中冷冻；
(4)将步骤(3)得到的所述碎末胶基型烟草制品用人工唾液浸泡20-40min，每隔2-5min搅动一次；所述人工唾液的温度为36-38℃；
(5)将步骤(4)得到的提取液离心分离5-10min；
(6)用渗透压测定仪测定步骤(5)得到的上层清液，调节其渗透压与细菌培养基一致，得到胶基型烟草制品提取液；
(7)测定提取液中的烟碱含量；
(8)体外培养人口腔微生物作为检测对象；
(9)将步骤(6)中获得的胶基型烟草制品提取液加入到步骤(8)中培养好的人口腔微生物中，涂布在对应的培养皿上，放置于厌氧培养箱内37℃培养48小时；
(10)取出步骤(9)中的培养物，查看生长情况并进行菌落计数。
本发明有益效果
1、本发明考虑到胶基型烟草制品难以采用直接浸泡法进行提取的特点，采用超低温(约-196℃)冷冻后粉碎，这可以将胶基这种黏黏糊糊的物质有效粉碎成粉末，然后将粉末再次用液氮超低温冷冻后，快速加入到常温(36-38℃)人工唾液中，利用从深冷迅速到常温的这种骤热效应，促使粉末因急剧热胀冷缩而进一步破碎，提高粉末与提取液的接触面积，从而提高从粉末中萃取化学物质的效率。
2、由于胶基型烟草制品通常为了增强口腔舒适感加入较多的糖分或者盐分等影响液体渗透压的物质，如果直接将提取液加入细菌中易导致由于渗透压的问题而引起细菌生长状态较差，因此本发明在处理细菌之前调节了提取液的渗透压，从而提高实验的准确性。
3、为了尽量模拟实际情况，本发明在提取时采用了人工唾液，并模拟了接近人口腔的温度和食用时间，提高了试验的可靠性。
4、本发明可应用于测定胶基型无烟气烟草制品对人口腔疾病相关多种微生物如变形链球菌、牙龈单胞卟啉菌的影响，仅需调整相对应的培养基，具有广泛适用性。
附图说明
无
具体实施方式
1.随机挑选一种胶基型烟草制品(N-2，尼古丁含量2mg/颗)，随机挑选2颗放入样品管中，将样品管置于液氮中冷冻30min。
2.将样品管从液氮中取出，再取出胶基型烟草制品(N-2)，立即用样品粉碎机将其粉碎，用样品管收集粉碎后的碎末。
3.将装有胶基型烟草制品碎末的样品管再次置于液氮中冷冻30min；
4.从液氮中取出样品管，立即加入10mL预热至37℃的人工唾液，浸泡粉碎后的胶基型烟草制品碎末(N-2)，采用37℃、30min的提取条件，并在浸泡过程中每隔2min搅动提取液以使样品与提取液充分接触从而利于内含物的溶出。
5.将提取液置于15mL离心管中，离心10min以沉淀固体物。
6.用移液器吸取上清置于新的离心管中，并使用渗透压测定仪测定提取液的渗透压，调节其渗透压与细菌培养基一致。
7.测定提取液中的尼古丁的浓度，以验证提取效率。
8.体外培养人口腔变形链球菌作为检测对象；
9.将胶基型烟草制品提取液按照原液、1:10、1:100的稀释倍数用无菌水稀释，再与培养的菌液1:1混合，总体积为50ul，涂布在对应的培养皿上，放置于厌氧培养箱内37℃培养48小时；
10.取出培养物，查看生长情况并进行菌落计数。
表1为不同稀释倍数的N-2提取液处理变形链球菌，测定N-2对变形链球菌生长的影响。由表1可以看出，与阴性对照相比，N-2型胶基型烟草制品在受试剂量范围内对变形链球菌生长无显著影响，阳性对照组菌落数显著低于阴性对照组的菌落数，证明本次试验体系正常，检测数据有效。
表1 N-2型胶基型烟草制品对变形链球菌体外影响检测结果