专利名称：Lrrc4基因启动子区甲基化检测在脑胶质瘤诊断中的应用及其检测系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及脑组织特异性表达基因LRRC4启动子区高甲基化在脑胶质瘤 早期诊断中的应用以及一种用于脑胶质瘤早期诊断的LRRC4基因启动子区甲 基化检测系统的开发。
背景技术：
2007年世界卫生组织统计表明在神经系统肿瘤中，胶质瘤发病率最高， 约占40.49%，综合发病年龄高峰在30-40岁，或10-20岁，严重影响了社会 生产力。几十年来，尽管尝试了各种改进的治疗及诊断方案，包括手术治疗、 化疗、放疗和影像诊断技术等，但恶性胶质瘤生存期仍没有明显提高。因此， 对人脑胶质瘤进行高危人群筛查和早期诊断，以便进行早期治疗，显著提高 患者生存率， 一直是神经科学临床研究的重要课题。
目前，脑胶质瘤的诊断、分期和分型所参考的标准，均是以临床、病理 学和影像学信息为基础，仍处于经验性标准的阶段，远远不能适应对人脑胶 质瘤进行高危人群筛查和早期诊断的需求。由于遗传性肿瘤标志物"单基因多 靶点"的本质特征和实体瘤细胞水平上的高度异质性严重地干扰遗传性(突 变，LOH和SNP)和表达性分子标志物的检出数据，使得生物标志物(遗传 性及表达性)在临床上的应用具有很大的局限性。近年来，以DNA甲基化为 代表的肿瘤表观遗传学及其在临床诊断、化疗敏感性和预后评价等方面的应 用价值，已经愈来愈受到生命科学工作者的重视，并显示出肿瘤特异性基因 甲基化异化谱式在探寻肿瘤分子标志物方面的巨大潜力。DNA甲基化的异化 可导致基因表达异常和基因组稳定性的降低，并能以半保守的方式高保真的 传递到子代细胞的基因组中，从而促进肿瘤的发生和发展。利用甲基化特异 性聚合酶链反应方法(MSP)分析所获得的肿瘤特异性甲基化谱式，有着定 性、正性指标的优点，很好地避免了上述生物标志物的不足。只要所分析的 靶点区在正常和肿瘤样品中为甲基化状态相反，用MSP法能够从多达104个 正常细胞中检测出l个肿瘤细胞，有着作为早期诊断手段的特异性和敏感性。
目前，通过各种体液或固态排泄物进行DNA甲基化谱式分析，对肿瘤高危人群进行普査已被提上议事日程。己有研究表明肺癌发病早期的轻度异型
增生阶段，痰中的脱落细胞中抑癌基因pl6INK4a启动子CpG岛可处于高甲 基化状态，预警着肺癌的到来。大便标本中SFRP2甲基化的程度是诊断结肠 癌最灵敏的标记。MGMT、 P73、 RB1、 P16INK4、 RASSF1A和p16启动子区 CpG岛的高甲基化，被认为与胶质瘤的发生相关。定量测定血浆中MGMT、 P73启动子的甲基化水平，可以作为诊断胶质瘤状态的生物学指标。此外，根 据hMLHl启动子的甲基化状态可判断恶性胶质瘤患者的预后。
发明内容
本发明的目的在于明确证实脑组织特异性表达基因LRRC4 (leucine-rich repeat C4)是脑胶质瘤特异性甲基化异化基因，因此提示脑组织特异性表达基 因LRRC4可用于胶质瘤的早期诊断。
本发明的另一目的在于制备出LRRC4基因启动子区甲基化检测系统，并
应用于脑胶质瘤的早期诊断、筛查和患病风险预测。
发明人发现脑组织特异性表达基因LRRC4在脑胶质瘤细胞、组织表达 下调或缺失。LRRC4启动子的活性区域-835至-293bp为一典型的CpG岛， 该CpG岛中CpG位点在正常的脑组织和配对血浆中均处于非甲基化状态，而 在LRRC4表达缺失或下调的脑胶质瘤细胞、组织和配对血浆中却存在高度的 甲基化。即使在胶质细胞增生(胶质瘤发生的极早期阶段)的组织和配对血 浆中，LRRC4的表达与正常脑组织的表达几乎没有任何差异时，仍然可以检 测到胶质细胞增生的组织和配对血浆中存在LRRC4启动子区的高甲基化状 态。用甲基化抑制剂5-氮-2脱氧胞苷处理LRRC4基因表达缺失的胶质瘤细胞， 可恢复LRRC4的表达，提示脑组织特异性表达基因LRRC4是脑胶质瘤特异 性甲基化异化基因，是胶质瘤敏感/特异性的早期诊断标志。
发明人在上述研究基础上，制备了用于人脑胶质瘤早期诊断的LRRC4基 因启动子区甲基化检测系统。该系统包括DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒和 LRRC4启动子区甲基化特异性PCR扩增试剂盒。DNA亚硫酸氢盐修饰试剂 盒包括A液—3M NaOH， B液--lOmM对苯二酚(氢醌)，C液—3.6M亚硫酸 氢钠(pH值5.0)，D液2MNaOH，E液10M醋酸胺以及硅胶纯化柱。LRRC4 启动子区甲基化特异性PCR扩增试剂盒包括用于一对甲基化引物和一对非甲 基化引物，甲基化特异性引物为
5,- AGCGTAGTATTTAGCGAGTGC -3 ， (F )， 5，-TAAACCCTAACACCGACTCG-3， (R);非甲基化特异性引物为
5 ，-GGGAGTGTAGTATTTAGTGAGTGT-3 ， ( F ) 5'-TAAACCCTAACACCAACTCACTC隱3， (R)。
以及用于甲基化对照的经亚硫酸氢盐修饰Sssl甲基化转移酶处理后的gDNA (-2(TC保存)；用于非甲基化对照的经亚硫酸氢盐修饰正常血gDNA (-20°C
保存)；及PCR扩增体系的其它常用试剂，如dNTP、 DNA聚合酶、缓冲液(-20
'C保存)等。
用本发明制备的脑组织特异性表达基因LRRC4启动子区甲基化检测系 统，从血浆中进行LRRC4启动子区特异性甲基化检测，可以定量检测各人群 血浆LRRC4启动子区甲基化状态，从而预测脑胶质瘤的患病风险，筛査易感 者，并对脑胶质瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。利用本发明所述检测 系统检测血衆LRRC4启动子区甲基化状态的特异性好，可达92%;灵敏度高， 只需经亚硫酸盐修饰后50ng组织或血浆gDNA即可检测出LRRC4的甲基化 状态。该检测系统操作简便、稳定性好，不仅可以用于脑胶质瘤的早期诊断， 而且适合用于脑胶质瘤的早期大规模人群筛查与患病风险预测，为脑胶质瘤 的早期诊断与防治提供了强有力的技术支持，具有深远的临床意义和推广性。
图l LRRC4基因启动子的CpG岛的识别结果图2 A图为胶质瘤细胞中LRRC4基因启动子区甲基化特异性PCR产物 电泳图；B图为正常脑组织细胞中LRRC4基因启动子区甲基化特异性PCR 产物电泳图3不同浓度甲基化酶抑制剂5-氮-2脱氧胞苷处理SF126和SF767胶 质瘤细胞后LRRC4表达RT-PCR产物电泳图4 A图为用本发明检测系统检测脑胶质瘤患者组织LRRC4启动子甲 基化状态的特异性PCR产物电泳图；B图为用本发明检测系统检测脑胶质瘤 患者血浆LRRC4启动子甲基化状态的特异性PCR产物电泳图。
具体实施例方式
脑组织特异性表达基因LRRC4 (leucine-rich repeat C4)是采用定位克隆 策略从染色体7q31-32区域克隆的新基因，GeneBank登录号AF196976。该 基因在脑瘤尤其是脑胶质瘤中表达下调或缺失，但未发现LRRC4基因的突变、 缺失与重排等遗传方式的改变。表观遗传学可能参与了 LRRC4基因的表达调 控。采用Promoterscan， Genomatix Promoter Inspector及CpGplot等生物信息 学软件对LRRC4基因5'端侧翼序列进行生物信息学分析，结果表明LRRC4 基因的启动子区域可能位于-2475bp至-101bp处(以起始密码子ATG中A为 +1)。通过构建系列缺失片段的荧光素酶(luciferase)报告基因方法初步确定 LRRC4启动子区域位于-835处至-293bp处(以起始密码子ATG中A为+1 )。 将LRRC4启动子的活性区域-835bp至-293bp与绿色荧光蛋白(GFP)编码区 相连，该片段能启动绿色荧光蛋白(GFP)的表达。LRRC4启动子的活性区 域-835bp至-293bp为一典型的CpG岛(参见附图1)。
针对LRRC4启动子活性区域-835bp至-293bp的CpG岛，设计并合成BSP 引物，扩增LRRC4启动子活性区域，并对胶质瘤细胞和正常脑组织进行经亚 硫酸盐处理后的基因组测序(BGS)，发现LRRC4基因启动子CpG岛中CpG 位点正常的脑组织均处于非甲基化状态，而在LRRC4表达缺失的胶质瘤细胞 SF126和SF767中却存在高度的甲基化(参见附图2)。采用不同浓度甲基化 酶抑制剂5-氮-2脱氧胞苷处理LRRC4基因表达缺失的胶质瘤细胞72h后，可 恢复LRRC4的表达(参见附图3)。
为了验证LRRC4启动区CpG岛在脑胶质瘤组织和配对血浆中的甲基化 状态，申请人收集了正常脑组织和配对血浆10例，不同级别脑胶质瘤组织标 本和配对血浆(手术之前)(I级10例，n-III级20例，四级暂缺)30例，用 LRRC4启动子区特异性甲基化引物，进行了 LRRC4启动子区甲基化状态的 检测，发现所有的正常脑组织中LRRC4启动子区均为完全非甲基化状态，而 所有的脑胶质瘤组织中LRRC4的启动子区均为半甲基化状态(参见附图 4-A), I级和II-III级胶质瘤的LRRC4启动子区甲基化水平没有明显的差异 (p>0.05)。同时，在配对血浆中也做了相应的检测，发现胶质瘤患者的血浆 中LRRC4的启动子区甲基化状态检出率虽然没有脑组织的甲基化状态检出率 高(参见附图4-B)，但与正常人血浆相比，明显升高((pO.Ol)。
以上研究结果提示，脑组织特异性表达基因LRRC4是一个脑胶质瘤特异 性甲基化基因，是一个敏感/特异性的胶质瘤早期诊断标志。 实施例1:脑组织特异性基因LRRC4甲基化检测系统的制备和操作
本发明的脑组织特异性基因LRRC4甲基化检测系统利用PCR的方法可 快速、准确地确定CpG岛的甲基化状况。根据系统工作原理，该系统包含2 类试剂盒DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒和LRRC4的甲基化特异性PCR扩增 试剂盒。该系统工作的原理分为3个步骤
(一) DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒制备及操作步骤
原理将DNA样本经亚硫酸氢盐处理，这种处理的特点是能够将未甲基化 DNA序列中的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化DNA序列中的胞嘧啶由于受 到甲基的保护而不发生转变。
内容该试剂盒主要包含试剂A液—3MNaOH 200pl， B液—10mM对苯二 酚(氢醌)lml， C液—3.6M亚硫酸氢钠(pH值5.0) 15ml， D液2MNaOH 200^1， E液10M醋酸胺1 ml;硅胶纯化柱50个。
操作步骤
如不特别指出，所用双蒸水(DDW)均经高压蒸汽灭菌。 1:将约2吗DNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50pl; 2:加5.5nlA液，42-C水浴30min;
3:加30iilB液至上述水浴后混合液中(溶液变成淡黄色)；
4:加C液520pl至上述水浴后溶液中；
5: EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液；
6:加200)il石蜡油(自备)，防止水分蒸发，限制氧化；
7: 5(TC避光水浴16h;
8:经修饰的DNA用硅胶纯化柱纯化后溶入50 水中，向纯化后的DNA中加
入D液5. 5pL，室温孵育20min。 9:加入E液33pL，加入3倍体积的无水乙醇(自备)，混匀，-8(TC过夜，离心，用70%乙醇(自备)洗涤，干燥后用20pL水溶解。 此操作过程中，基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后 纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug;步骤7最好达16小 时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。
(二) LRRC4的甲基化特异性PCR扩增试剂盒
内容该试剂盒包括用于检测LRRC4基因启动子区甲基化引物和一对非甲基 化引物。
甲基化引物(M型)5'-AGCGTAGTATTTAGCGAGTGC-3， (F)
5'-TAAACCCTAACACCGACTCG-3， (R); 非甲基化弓l物(U型)5'-GGGAGTGTAGTATTTAGTGAGTGT画3， (F)
5'誦TAAACCCTAACACCAACTCACTC-3， (R)
甲基化对照经亚硫酸氢盐修饰SssI甲基化转移酶处理后的gDNA (-20'C保存)
非甲基化对照经亚硫酸氢盐修饰正常血gDNA (-2(TC保存) PCR扩增体系(-20'C保存)
原理利用甲基化和非甲基化特异性引物进行PCR扩增确定LRRC4启动子 的甲基化状态。该组引物含2种类型， 一类称为U型引物，另一类称为M型 引物。前者利用A-U配对只能与亚硫酸氢盐处理后的未甲基化DNA结合， 后者利用G-C配对只能与亚硫酸氢盐处理后甲基化DNA结合。 操作步骤
1. 取经亚硫酸氢盐修饰后的样品DNA2pl (总量约50ng)，分别加入含甲 基化和非甲基化特异性引物(各2pl)的PCR扩增体系(23|li1)，使用 LAT叫酶进行扩增。 PCR扩增体系为
LATaq(5U/|il) 0.25|il 2XGC buffer I 12， dNTP Mixture(各2.5mM) 4jxi Primers 2|il H20 4.25^1
23 pi
2. 加样后，置PCR仪进行PCR扩增，反应条件如下
95 。C 5 min
94 °C 45 sec
58°C 45 sec 38 Cycles
72°C 45 sec —
72 °C 10 min
(三)琼脂糖电泳鉴定，判断甲基化情况
取5^1 PCR产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳30min，经溴乙啶染色，紫外 灯观察特异性条带情况，甲基化引物和非甲基化引物的产物均为153bp(参考 甲基化和非甲基化对照)。如果只有甲基化引物有特异性条带，表示LRRC4 启动子为完全甲基化状态;如果只有非甲基化引物有特异性条带，表示LRRC4 启动子为完全非甲基化状态；如果甲基化引物和非甲基化引物均有特异性条 带，则表示LRRC4的启动子为不完全或半甲基化状态。实施例2:脑组织特异性基因LRRC4甲基化检测系统的特异性、灵敏性及稳定 性检测
收集30例胶质瘤病人手术前的全血5ml分离血浆(-7(TC冰箱储存)，并 收集同一病人的胶质瘤组织标本(液氮灌冻存)，同时收集10例正常脑组织 及配对血浆作正常对照。
取lml血浆按照上海华舜生物公司Cell-Free DNA Isolation Kit抽提步骤 提取血浆中游离的gDNA。取30mg脑瘤或正常脑组织剪碎，加入200^1 TE 缓冲液，400nl细胞裂解液(10 mmol/LTris-Cl (pH 8.0)， lmmol/L EDTA (pH 8.0)， 0.5% SDS)，再加20|il蛋白酶K(20mg/ml)， 55。C过夜消化。煮沸10min, 灭活蛋白酶K， 6000rpm离心10min，取上清液加等量的酚氯仿异丙醇 =25:24:1，颠倒混匀，14000rpm离心10min，取上层水相，加等量的氯仿，颠 倒混匀，14000rpm离心10min;取上层水相，加0.2倍体积的乙酸钠(pH 5.2)， 2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，置-20。C lh后，14000rpm离心5min。再加70% 的乙醇lml漂洗沉淀，7500rpm离心5min，沉淀干燥20min，力[U00nlTE(含 RNAase 100ug/ml)，置37'C摇床振摇至沉淀溶解。分光光度计测量DNA的浓 度及质量，OD260/OD280比值在1.6 1.8。
取上述抽提的血桨或脑组织/脑胶质瘤组织的gDNA2pg，采用本发明脑组 织特异性基因LRRC4甲基化检测系统中的亚硫酸氢盐修饰试剂盒进行修饰， 步骤见(一)，使未甲基化的C转化为U。
分别取上述修饰后的DNA，加入本发明脑组织特异性基因LRRC4的甲 基化特异性PCR扩增试剂盒中含甲基化和非甲基化特异性引物的PCR扩增体 系，置PCR仪上按步骤(二)中条件扩增。取5plPCR产物行琼脂糖凝胶电 泳，按步骤(三)判定LRRC4启动子甲基化状态。
通过该方法检测发现30例胶质瘤病人组织中LRRC4的启动子均为完全 甲基化状态，而10例正常脑组织均为完全非甲基化状态；30例胶质瘤病人血 浆中28例检测出LRRC4的启动子存在甲基化状态，2例检测为完全非甲基化 状态，而10例正常人血清均为完全非甲基化状态。因此，检测脑组织特异性 基因LRRC4启动子甲基化状态用于胶质瘤的诊断具有良好的特异性，并且血 浆中LRRC4的甲基化状态能较好反映脑组织中LRRC4的甲基化状态，说明 该试剂盒具有很好的特异性。
本发明检测系统能够检测出经亚硫酸盐修饰后50ngDNA的LRRC4的特 异性甲基化状态，说明该试剂盒具有较高的灵敏度。分别取同一批正常人(20例)和同一批脑胶质瘤病人(20例)的血衆， 利用本发明进行LRRC4甲基化状态的检测，共重复10次，按公式变异系数 CV-S/XX100。/。(S为标准差，X为平均值)计算批间及批内变异系数。最终得 到批内与批间变异系数分别为5.01%和4.63%，说明该检测方法稳定性好。
实施例3脑组织特异性基因LRRC4甲基化检测系统的临床应用
收集100例经临床及影像学诊断疑似脑胶质瘤患者手术前的全血5ml，按 前述方法分离血桨中游离的gDNA，同时对患者手术后的组织进行病理诊断。 利用本发明脑组织特异性基因LRRC4甲基化检测系统进行患者血浆gDNA的 LRRC4基因启动子区的甲基化检测。
先用本发明的DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒对血浆gDNA样本进行亚硫酸 氢盐修饰，具体操作见前述步骤(一)。
再取经亚硫酸氢盐修饰后的样品DNA 2|il，分别加入本发明脑组织特异 性基因LRRC4的甲基化特异性PCR扩增试剂盒中含甲基化和非甲基化特异 性引物(各2pl)的PCR扩增体系(23^1)，置PCR仪上按步骤(二)中条件 扩增。取5plPCR产物行琼脂糖凝胶电泳，按步骤(三)判定LRRC4启动子 甲基化状态。
100例疑似胶质瘤病人中92例患者血浆中LRRC4启动子存在甲基化状 态，判定为脑胶质瘤病人。病理结果显示92例患者为胶质瘤病人，与本发明 检测的结果完全一致。
权利要求
1.脑组织特异性表达基因LRRC4启动子区甲基化检测在脑胶质瘤的早期诊断、筛查和患病风险预测中的应用。
2. —种LRRC4基因启动子区甲基化的检测方法，将组织或血浆样本gDNA 经亚硫酸氢盐修饰处理，将未甲基化DNA序列中的胞嘧啶转化为尿嘧啶；再 利用甲基化和非甲基化特异性引物进行PCR扩增，将PCR产物进行电泳，确 定LRRC4启动子的甲基化状态；所述甲基化特异性引物为5 ，- AGCGTAGTATTTAGCGAGTGC -3 ， ( F)， 5'-TAAACCCTAACACCGACTCG-3， (R);所述非甲基化特异性引物为5 ，-GGGAGTGTAGTATTTAGTGAGTGT画3 ， ( F ) 5，-TAAACCCTAACACCAACTCACTC-3， (R)。
3. —种LRRC4基因启动子区甲基化检测系统，其特征在于包括DNA亚硫 酸氢盐修饰试剂盒和LRRC4启动子区甲基化特异性PCR扩增试剂盒；所述 DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒包括A液—3MNaOH， B液—10mM对苯二酚(氢 醌)，C液—3.6M亚硫酸氢钠(pH值5.0)， D液2 M NaOH， E液10M醋 酸胺以及硅胶纯化柱；所述LRRC4启动子区甲基化特异性PCR扩增试剂盒 包括一对甲基化引物5'-AGCGTAGTATTTAGCGAGTGC-3， (F)5，國TAAACCCTAACACCGACTCG-3， (R); 和一对非甲基化引物5'-GGGAGTGTAGTATTTAGTGAGTGT-3， (F)5,-TAAACCCTAACACCAACTCACTC-3， (R);以及 作为甲基化对照的经亚硫酸氢盐修饰SssI甲基化转移酶处理后的gDNA;作为 非甲基化对照的经亚硫酸氢盐修饰正常血gDNA和dNTP、 DNA聚合酶和缓冲 液。
4. 如权利要求3所述的检测系统，其特征在于所述DNA聚合酶为5U/pl 的LATaq，所述缓冲液为2.5mM的2XGC buffer I，所述dNTP浓度为2.5mM。
5. LRRC4基因启动子区甲基化检测系统的使用方法，其特征在于包括以下使 用步骤(1) 提取待测样品血浆gDNA，用所述亚硫酸氢盐修饰试剂盒对血浆gDNA 进行修饰；(2) 取经亚硫酸氢盐修饰后的gDNA，用所述LRRC4启动子区甲基化特异 性PCR扩增试剂盒对经亚硫酸氢盐修饰后的gDNA进行PCR扩增；(3) 取PCR产物进行电泳，判定LRRC4启动子甲基化状态。
全文摘要
本发明公开了LRRC4基因启动子区甲基化检测在脑胶质瘤诊断中的应用及其检测系统，脑组织特异性表达基因LRRC4是脑胶质瘤特异性甲基化异化基因，因此提示LRRC4基因启动子区甲基化检测可应用于胶质瘤的早期诊断，并制备出LRRC4基因启动子区甲基化检测系统，包括DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒和LRRC4启动子区甲基化特异性PCR扩增试剂盒。本发明检测系统检测血浆LRRC4启动子区甲基化状态的特异性可达92％，灵敏度高，可以定量检测各人群血浆LRRC4启动子区甲基化状态，从而对脑胶质瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。
文档编号C12Q1/68GK101298629SQ20081003154
公开日2008年11月5日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者刘恩伊, 张祖萍, 丹 李, 李夏雨, 李小玲, 李桂源, 武明花, 攀 陈 申请人:中南大学