专利名称：采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌的检测方法，具体涉及一种结核杆菌的检测方法。
背景技术：
结核杆菌感染所引起的结核病是威胁人类健康的重要传染性疾病之一，本世纪80年 代中期以来在全球出现回升趋势。目前，全世界已有三分之一的人口受结核杆菌感染， 每年新发病例超过800万人，死亡病例超过200万人。因此，结核杆菌的快速、灵敏检 测对于结核病的诊断、管理与控制具有十分重要的意义。
传统的结核杆菌检测方法主要有涂片抗酸染色法和培养法，目前医院对结核病的诊 断仍然依赖于这两种方法。涂片抗酸染色法快速简便，但灵敏度很低；改良罗氏培养基 培养法灵敏度高，但耗时长，通常需4 6周方可确定结果。近年来，许多快速检测结核 杆菌的方法陆续发展起来，包括结核杆菌快速培养兼鉴定系统，如BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养/鉴定/药敏系统等；分子生物学方法，如聚合酶链反应(PCR) 法、核酸探针等；免疫学方法，如酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫色谱分析(ICA) 等。这些方法对提高检测的灵敏度和准确性做出了巨大的贡献，但仍存在一些不足之处。 例如，结核杆菌快速培养系统极大地縮短了细菌的培养时间，但仍需要数日；PCR法灵 敏度很高，但容易出现假阳性和假阴性问题；ELISA法简单价廉，但其灵敏度有待提高。 因此，探求准确、快速、灵敏地检测结核杆菌的方法一直为医学界所关注。
流式细胞术(FCM)是利用流式细胞仪对细胞或其他微小生物颗粒的多种物理、生 物学参数同时进行定量分析的技术，它能在单细胞水平辨认细胞形态、大小和荧光特征， 具有检测速度快、采集数据量大、能同时进行多参数检测、方法灵活客观等优良特性， 目前已成为一种重要的细菌检测手段，并应用于环境、食品以及生物医学等相关领域。 将流式细胞术应用于结核杆菌的快速检测无疑是一种新的机遇。然而，由于细菌体积微 小、各种菌体成份含量相对较低，因此采用流式细胞术来实现对细菌的高灵敏检测仍然 是一种挑战。传统荧光染料作为标记物其荧光强度已难以满足高灵敏检测的需要，因而 需要发展更明亮的荧光标记物。近年来，各种发光纳米颗粒，包括量子点、荧光乳胶颗 粒以及二氧化硅荧光纳米颗粒等，由于具有更高的荧光强度和更好的光稳定性而成功地应用于生物标记及病原菌检测等领域。这些发光纳米颗粒标记技术为采用流式细胞术来 实现对细菌的高灵敏检测提供了一种新的思路。曾有研究小组尝试用量子点标记抗体与 流式细胞术相结合用于隐孢子虫卵的检测，但意外的是，检测结果竟不如传统有机染料， 主要是因为量子点本身带来了很多的假阳性信号 一方面，量子点的团聚使背景噪声显 著增大，从而导致假阳性增大；另一方面，量子点对样品中颗粒性杂质的非特异性吸附 造成假阳性增大。因此，发展新方法以克服上述假阳性问题成为采用发光纳米颗粒作为 标记物与流式细胞术结合来实现对细菌高灵敏检测这一技术的关键。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种检测时间短、检测灵敏 度高且假阳性率低的釆用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种采用双色流式细胞术检测结核 杆菌的方法，其特征在于首先以荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与待测样品进行免疫 共培育，然后以核酸染料对培育后的待测样品进行染色，最后采用多参数流式细胞术对 染色后的待测样品进行测定，根据检测到的单位体积中具有荧光双阳性信号的对象的数 量来对待测样品中结核杆菌的检测结果进行分析和判断，所述的荧光双阳性信号为由荧 光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物所发出的不同颜色的荧光信号。所述荧光纳米颗 粒标记的结核杆菌抗体用于灵敏、特异性地对结核杆菌进行免疫荧光染色，而核酸染料 用于对细菌进行核酸染色以区分细菌与待测样品中的其它颗粒性杂质，整个检测过程(包 括样品预处理)可在2 3h完成。
上述荧光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物具有不同的荧光最大发射波长，且两 者之间的差值不小于45mn。
上述荧光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物的荧光最大激发波长、荧光最大发射 波长均处于300 700nm之间。
上述荧光纳米颗粒可以选用嵌合联吡啶钌配合物(Ru(BPY)3)的二氧化硅荧光纳米 颗粒，所述核酸染料可以选用SYBR Green I。
作为本发明的进一步改进，上述技术方案具体包括以下检测步骤
(1)对待测样品进行免疫荧光染色利用以结核杆菌细胞壁抗原为免疫原的结核杆 菌抗体能与结核杆菌特异性结合这一特性，将嵌合联吡啶钌配合物的二氧化硅荧光纳米 颗粒标记的结核杆菌抗体与待测样品在缓冲液中于35 37'C培育1 2h;当样品中含有 结核杆菌时，结核杆菌细胞壁就会结合上大量荧光纳米颗粒，形成荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物；
(2) 对待测样品中的细菌进行核酸染色:利用核酸染料SYBR Green I能与双链DNA 迅速结合并发出明亮的荧光且背景荧光低这一特性，在免疫培育后的待测样品中加入核 酸染料SYBR Green I，室温下染色15 20 min;当样品中含有结核杆菌时，核酸染料SYBR Green I会渗透进入结核杆菌中并与其双链DNA结合，形成SYBR Green I-双链DNA复 合物，借此将结核杆菌与待测样品中的其它颗粒性杂质区分开来；
(3) 多参数流式细胞术的测定与分析采用流式细胞仪对上述经过荧光纳米颗粒标 记的抗体和核酸染料SYBR Green I双染色后的待测样品进行测定，若待测样品中含有结 核杆菌，则经过上述步骤(1)和(2)的染色后，会同时形成荧光纳米颗粒-结核杆菌复 合物和SYBR Green I-双链DNA复合物，通过流式细胞仪配置的488 nm的氩离子激光器 激发，荧光纳米颗粒会发出红色荧光，而被核酸染料SYBR Green I染色的结核杆菌还会 同时发出绿色荧光，两种颜色的荧光信号能被仪器同时检测到，通过统计单位体积中具 有红色荧光和绿色荧光双阳性信号的对象的数量，来对待测样品中结核杆菌的检测结果 进行分析和判断；当单位体积中红色荧光和绿色荧光双阳性信号的数量小于或等于"背 景信号+3倍噪声"时，可判断待测样品中不含有结核杆菌。所述背景信号和噪声分别指 五组不含有结核杆菌的阴性对照样品所测得的单位体积中双阳性信号数量的平均值和标 准偏差。
与现有技术相比，本发明方法通过将荧光纳米颗粒的信号放大作用与流式细胞术能 同时进行多参数、快速检测的特点有机地结合在一起，大大縮短了检测时间，与使用普 通有机染料作为荧光标记物的传统流式细胞术相比，具有更高的检测灵敏度；在荧光纳 米颗粒标记的特异性抗体识别的基础上，增加核酸染料作为第二步的确证，这不仅极大 地减小了荧光纳米颗粒团聚所造成的高背景噪声，同时也减少了荧光纳米颗粒与样品中 颗粒性杂质的非特异性吸附所造成的假阳性信号，与采用发光纳米颗粒作为荧光标记物 的单色流式细胞术相比，显著地降低了检测方法中的假阳性率。此外，本发明方法所使 用的核酸染料能有效区分细菌与样品中其它的颗粒性杂质，因而在进行样品测定前无需 通过离心、过滤等洗涤步骤将过量的未与目标细菌结合的纳米颗粒-抗体复合物除去，因 此可减小洗涤过程中所造成的细菌团聚与损失，进一步简化了检测步骤、縮短了检测时 间。
图1为实施例1中分别采用双色流式细胞术与单色流式细胞术进行检测的结果对比图。
图中(A) (C)为采用荧光纳米颗粒的单色流式细胞术进行检测的二维点图，其 中R1为红色荧光阳性区；(D) (F)为采用荧光纳米颗粒与核酸染料的双色流式细胞 术进行检测的二维点图，其中UR表示绿色荧光和红色荧光双阳区，LL表示绿色荧光和 红色荧光双阴区，LR表示红色荧光单阳区，UL表示绿色荧光单阳区；
(A) ——荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与无菌缓冲液培育；
(B) ——修饰了葡萄球菌A蛋白的荧光纳米颗粒与含有结核杆菌的缓冲液培育；
(C) ——荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与含有结核杆菌的缓冲液培育；
(D) ——荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与无菌缓冲液培育，再经SYBR Green I染色；
(E) ——修饰了葡萄球菌A蛋白的荧光纳米颗粒与含有结核杆菌的缓冲液培育， 再经SYBRGreenI染色；
(F) ——荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与含有结核杆菌的缓冲液培育，再经 SYBRGreenI染色。
图2为采用双色流式细胞术在缓冲液体系中检测到的单位体积中具有荧光双阳性信 号的对象的数量随结核杆菌浓度变化的关系图(纵坐标的比例为对数)。
图3为采用双色流式细胞术对实施例2中合成尿液检测的二维点图，其中UR表示 双阳性信号区。
图中(A)——不含结核杆菌的尿液经检测后的二维点图； (B)——含有结核杆菌的合成尿液经检测后的二维点图。
图4为采用双色流式细胞术在合成尿液中检测到的单位体积中具有荧光双阳性信号 的对象的数量随结核杆菌浓度变化的关系图(纵坐标的比例为对数)。
具体实施例方式
实施例h
将荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与含有6.0xl06 cells/mL结核杆菌的缓冲液(该 缓冲液为含有质量分数为1 °/。的牛血清白蛋白和0.05 %的吐温80的pH 7.4 、 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液)在37 。C培育1 h,将核酸染料SYBR Green I商品储存液以稀释10,000 倍的终浓度加入上述培育后的溶液中，室温下染色15min，染色后的样品直接上流式细 胞仪测定。以流式细胞仪配置的488nm的氩离子激光器激发，用FLl检测器(530土15nm 带通滤光片)来检测被SYBR Green I所染色的细菌的绿色荧光，用FL3检测器(610nm长通滤光片)来检测荧光纳米颗粒的红色荧光，分析检测结果如图1 (F)所示，由图1 (F)可见，由于目标结核杆菌既结合了荧光纳米颗粒又被SYBR Green I所染色，因此 绿色荧光和红色荧光双阳区(UR区)能够检测到细菌群。
为了与使用荧光纳米颗粒作为荧光标记物的单色流式细胞术进行比较，另设以下五 组对照样品
样品(1):将荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与无菌缓冲液培育，然后用单色流
式细胞术进行检测，结果如图1 (A)所示；
样品(2):将表面修饰了葡萄球菌A蛋白的荧光纳米颗粒与含有6.0xlO、ells/mL结 核杆菌的缓冲液培育，然后用单色流式细胞术进行检测，结果如图1 (B)所示；
样品(3):将荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与含有6.0xlO、ells/mL结核杆菌的 缓冲液培育，然后用单色流式细胞术进行检测，结果如图1 (C)所示；
样品(4):将荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与无菌缓冲液培育，再经SYBR Green I染色后，用双色流式细胞术进行检测，结果如图l (D)所示；
样品(5):将表面修饰了葡萄球菌A蛋白的荧光纳米颗粒与含有6.0xlO、ells/mL结 核杆菌的缓冲液培育，再经SYBRGreenI染色后，用双色流式细胞术进行检测，结果如 图1 (E)所示。
图1 (A) (C)是仅使用荧光纳米颗粒作为荧光标记物的情况，图1中的(A) 和(B)显示出大量的假阳性信号(Rl区域内)，检测后发现样品(1)和(2)分别有 88.49%和13.03%的假阳性信号，这些假阳性信号主要是由过量的未与目标结核杆菌结合 的荧光纳米颗粒团聚体所产生。图l (D) (F)是荧光纳米颗粒与SYBRGreenI双染 色的情况，由于过量的未与目标结核杆菌结合的荧光纳米颗粒不能被SYBRGreenI所染 色，因此显示为红色荧光单阳性，出现在图(D) (F)中的LR区，能区别于出现在 UR区的双阳性信号，这使得样品(4)和(5)的假阳性信号(UR区内)分别减至0.57% 和1.85%，本发明方法的假阳性率得到了显著的降低。据此，单色流式细胞术检测的图 (C)与双色流式细胞术检测的图(F)虽然都能显示出检测到结核杆菌的阳性信号，但 本发明的双色流式细胞术检测的可靠性要远大于单色流式细胞术。
采用与图l(F)所示样品相同的双色流式细胞术检测步骤对七组分别含有0 cells/mL、 6.0xl03cells/mL、 2.0x104 cells/mL、 6.0x104 cells/mL、 2.0><105 cells/mL、 6.0x105 cells/mL、 2.0xl06 cells/mL结核杆菌的23个样品进行检测(其中除结核杆菌浓度为0 cells/mL的样 品组有五个样品以外，其余各浓度的样品组均包含三个样品)，统计各样品所检测到的同时具有荧光纳米颗粒荧光与SYBR Green I荧光的双阳性对象的数量(UR区内)并对样 品中结核杆菌的浓度作图，如图2所示。由图可见，随着样品中结核杆菌浓度的增大， 在双阳区检测到的信号也随之增多；在结核杆菌浓度为6.0xl03 2.0xl06 cells/mL范围 内，本方法所检测到的单位体积中具有荧光双阳性信号的对象的数量与结核杆菌的浓度 具有较好的线性关系，检测限为3.5xl03 cdls/mL结核杆菌。与使用异硫氰酸荧光素 (FITC)标记抗体的传统流式细胞术相比，本实施例的灵敏度有一个数量级的提高。 实施例2:
采用荧光纳米颗粒与核酸染料SYBR Green I的双色流式细胞术快速检测合成尿液样 品中的结核杆菌，检测步骤及结果如下所述
从不同健康人中收集23份中段尿，每份取lmL尿样，往其中的18份尿液样品中分 别惨入不同浓度的结核杆菌制成6组分别含有l.OxlO4 cells/mL、2.0x104 cells/mL、3.0x104 cells/mL、 5.0><104 cells/mL、 l.OxlO5 cells/mL、 1.0x106 cells/mL结核杆菌的合成尿样，每 组合成尿样中含三个结核杆菌浓度相同的合成尿液样品，其余的5份尿液样品不掺结核 杆菌。将上述各样品以12,000 rpm的速度离心5 min，弃去上清，加入1 mL磷酸盐缓冲 液，按相同的离心条件离心洗涤一次，最后悬浮在200pL缓冲液中(该缓冲液为含有质 量分数为1 %的牛血清白蛋白和0.05 %吐温80的pH 7.4、 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液)。将 荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体分别与上迷处理过的各样品在37 t:培育l h，将SYBR Green I商品储存液以稀释10,000倍的终浓度分别加入到上述样品中，室温下染色15 min， 染色后的各样品直接上流式细胞仪测定。以流式细胞仪配置的488 nm的氩离子激光器激 发，用FL1检测器(530士15nm带通滤光片)来检测被SYBR Green I所染色的细菌的绿 色荧光，用FL3检测器(610nm长通滤光片)来检测荧光纳米颗粒的红色荧光。图3是 其中的两份样品的检测结果图，图3(A)为未掺杂结核杆菌的阴性尿液对照样品的分析结 果图，图3(B)为含有1.0xl()Scells/mL结核杆菌的阳性合成尿液样品的分析结果图。由图 3(B)可见，阳性样品在双阳区(UR区)显示出大量信号，证明目标结核杆菌被检测出， 而阴性对照样品在双阳区几乎没有信号，这进一步验证了本发明方法的可行性。统计各 样品所检测到的单位体积中双阳性对象的数量并对样品中结核杆菌的浓度作图，如图4 所示。由图可见，随着合成尿液样品中结核杆菌浓度的增大，在双阳区检测到的信号也 随之增多，检测限为3.0xlO、ells/mL结核杆菌。
上述各实施例中用到的荧光纳米颗粒为嵌合联吡啶钌配合物的二氧化硅荧光纳米颗 粒，该嵌合联吡啶钌配合物的二氧化硅荧光纳米颗粒用以下方法制得将7.5mL的环己烷、1.8mL的表面活性剂曲拉通X-100和1.8mL的正己醇混合均匀，加入400 nL水作 为分散相，搅拌均匀后形成反相微乳液，加入50pL0.1mol/L联吡啶钌配合物的水溶液， 搅拌均匀后加入200 nL正硅酸乙酯和200 pL氨水，反应24h后加入丙酮破乳，离心收 集纳米颗粒，依次用丙酮、乙醇、水洗涤反应后的纳米颗粒，由此可制得嵌合联吡啶钌 配合物的二氧化硅荧光纳米颗粒。
上述各实施例中修饰了葡萄球菌A蛋白的荧光纳米颗粒和荧光纳米颗粒标记的结核 杆菌抗体用以下方法制得将IO mg上述制得的嵌合联吡啶钌配合物的二氧化硅荧光纳 米颗粒经高压灭菌后悬浮于2 mL 2 mol/L的无菌碳酸钠溶液中，超声分散10 15 min， 在剧烈的磁搅拌下将2 mL 0.64 g/mL的溴化氰的乙腈液逐滴滴至上述荧光纳米颗粒的悬 浮液中，反应5min，加入30mL无菌冰水终止反应，依次用无菌冰水和无菌冷磷酸盐缓 冲液对纳米颗粒各洗三次，再将其悬浮于lmL的无菌磷酸盐缓冲液中，制得溴化氰活化 的荧光纳米颗粒；在1 mL溴化氰活化的荧光纳米颗粒中加入100 nL 1 mg/mL的葡萄球 菌A蛋白，4 r轻微振荡24h，再用无菌磷酸盐缓冲液洗三次后，加入l mL含有质量 分数为1 %牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，4 'C轻微振荡16h以封闭反应，用无菌磷酸 盐缓冲液洗三次，悬浮在l mL无菌磷酸盐缓冲液中，制得修饰了葡萄球菌A蛋白的荧 光纳米颗粒；在1 mL上述被修饰了葡萄球菌A蛋白的荧光纳米颗粒悬浮液中加入50 4 mg/mL的结核杆菌抗体，37 。C培育2h，用无菌磷酸盐缓冲液洗三次，悬浮在含有质 量分数为1 %的牛血清白蛋白、0.05 %的吐温80和0.02 %的叠氮化钠的无菌磷酸盐缓冲 液中，制得荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体，贮存于4 'C备用。
权利要求
1. 一种采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法，其特征在于首先以荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与待测样品进行免疫共培育，然后以核酸染料对培育后的待测样品进行染色，最后采用多参数流式细胞术对染色后的待测样品进行测定，根据检测到的单位体积中具有荧光双阳性信号的对象的数量来对待测样品中结核杆菌的检测结果进行分析和判断，所述的荧光双阳性信号为由荧光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物所发出的不同颜色的荧光信号。
2、 根据权利要求1所述的釆用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法，其特征在于所 述荧光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物具有不同的荧光最大发射波长，且两者之间 的差值不小于45 nm。
3、 根据权利要求1或2所述的采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法，其特征在 于所述荧光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物的荧光最大激发波长、荧光最大发射波 长均处于300 700 nm之间。
4、 根据权利要求3所述的采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法，其特征在于所 述荧光纳米颗粒为嵌合联吡啶钌配合物的二氧化硅荧光纳米颗粒，所述核酸染料为SYBR Grccn L
5、 根据权利要求4所述的采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法，其特征在于具体包括以下检测步骤(1) 对待测样品进行免疫荧光染色将嵌合联吡啶钌配合物的二氧化硅荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与待测样品在缓冲液中于35 37 'C培育1 2h;(2) 对待测样品中的细菌进行核酸染色在免疫培育后的待测样品中加入核酸染料 SYBR Green I，室温下染色15 20 min;(3) 多参数流式细胞术的测定与分析采用流式细胞仪对上述经过核酸染料SYBR Green I染色后的待测样品进行测定，根据检测到的单位体积中具有荧光双阳性信号的对 象的数量来对待测样品中结核杆菌的检测结果进行分析和判断。
6、 根据权利要求5所述的采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法，其特征在于所 述嵌合联吡啶钌配合物的二氧化硅荧光纳米颗粒用以下方法制得将7.2 7.5体积的环 己烷、1.6 1.8体积的表面活性剂曲拉通X-100和1.6 1.8体积的正己醇混合均匀，加入0.4 0.8体积的水作为分散相，搅拌均匀后形成反相微乳液，加入0.05 0.18体积 0.05 0.1 mol/L的联吡啶钌配合物的水溶液，搅拌均匀后加入0.2 0.4体积的正硅酸乙 酯和0.1 0.2体积的氨水，反应20 24h后加入丙酮破乳，离心收集纳米颗粒，并依次 用丙酮、乙醇、水洗涤反应后的纳米颗粒，得到嵌合联吡啶钌配合物的二氧化硅荧光纳 米颗粒。
7、根据权利要求5所述的采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法，其特征在于所 述荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体用以下方法制得荧光纳米颗粒经高压灭菌后悬浮 于2.0 2.5 mol/L无菌碳酸钠溶液中，将溴化氰的乙腈液逐滴滴至纳米颗粒悬浮液中使其 终浓度为0.2 0.5 g/mL，反应5 10min，加入无菌冰水终止反应，分别用无菌冰水和无 菌冷磷酸盐缓冲液洗涤颗粒，悬浮于无菌磷酸盐缓冲液中制得溴化氰活化的荧光纳米颗 粒；在溴化氰活化的荧光纳米颗粒中加入终浓度为0.05 0.2mg/mL的葡萄球菌A蛋白， 4 8 'C轻微振荡20 24 h，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，加入质量分数为1 2 %的牛 血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，4 8 t轻微振荡16 20h以封闭反应，用无菌磷酸盐缓冲 液洗涤，悬浮在无菌磷酸盐缓冲液中制得修饰了葡萄球菌A蛋白的荧光纳米颗粒；在修 饰了葡萄球菌A蛋白的荧光纳米颗粒悬浮液中加入终浓度为0.1 0.4 mg/mL的结核杆菌 抗体，35 37 。C培育2 3h，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤，悬浮在含有质量分数为1 2% 的牛血清白蛋白、0.05 0.1 %的吐温80和0.01 0.02%的叠氮化钠的无菌磷酸盐缓冲液 中，制得荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体。
全文摘要
本发明公开了一种采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法，其特点是首先以荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与待测样品进行免疫共培育，然后以核酸染料对待测样品进行染色，最后以多参数流式细胞术对待测样品进行测定与分析，根据检测到的单位体积中具有荧光双阳性信号的对象的数量来对待测样品中结核杆菌的检测结果进行分析和判断。本发明方法将荧光纳米颗粒的信号放大作用与能同时进行多参数、快速检测的流式细胞术有机地结合，具有快速、灵敏度高的优点，通过增加核酸染料的染色，能够大大降低检测的假阳性率。
文档编号C12Q1/68GK101285775SQ20081003139
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者何晓晓, 王柯敏, 秦迪岚, 谭蔚泓 申请人:湖南大学