专利名称：酵母浓度的流式细胞术检测方法
技术领域：
本发明涉及一种酵母浓度的检测方法，属于生物工程技术领域，特别是涉及一种酵母浓度的流式细胞术检测方法。
背景技术：
酿酒(如葡萄酒、啤酒等)要经过发酵过程。影响发酵过程的因素很多，如发酵液的成分和浓度、溶解氧含量、温度、PH值、搅拌速度、酵母的种类、活性和浓度等等。在上述因素中，酵母浓度是最重要的工艺参数，因为在一定条件下，发酵的得率与酵母浓度密切相关。酵母的存在会改变发酵液的电特性，发酵液在无线电频率范围内的电特性可用电容率和电导率充分地描述。·实验证实发酵液在无线电频率范围内的电容率增量是测量频率和生物量浓度的函数。酵母浓度反映了酵母的生长速率和增值状况，是酵母培养和发酵过程中的监控指标。目前，测定酵母浓度一般采用血球板计数法，但该方法操作误差大，重复性较差，耗时。流式细胞术是一种以单个细胞为对象的检测技术，具有快速、客观准确、重复性好、可同时测定多个指标等优点，在医学临床研究中的应用十分广泛，但在酵母发酵监测中的应用仍较少。
发明内容
本发明的目的在于快速测定酵母浓度的流式细胞术检测方法，该方法测定量大，具有准确性高、重复性好、操作简便快速等特点。本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种酵母浓度的流式细胞术检测方法，包括以下步骤:I)测定流式细胞仪的上样速度；2)制备酵母悬液；3)利用流式细胞仪测定酵母浓度。本发明实施例的检测方法，步骤I)的测定流式细胞仪的上样速度，是这样操作的:在流式上样管中加入一定的蒸馏水，称量管和水总重量，记为初重；然后以慢速进行上样，上样一定时间后立即停止上样，取下上样管称量管和水总重量，记为末重，根据上样速度计算公式计算流式细胞仪在慢速状态下的上样速度，重复测定5次以上，计算平均值。本发明实施例的检测方法,所述上样速度计算公式:上样速度(ml/min)=(初重-末重)+水密度(lg/ml) -T-上样时间(min)。本发明实施例的检测方法，步骤2)的制备酵母悬液，是取酵母液，用200目筛网过滤，再用酵母培养液或蒸馏水调整酵母浓度后得到酵母悬液。本发明实施例的检测方法，所述酵母悬液中的酵母浓度的数量级优选IO6个/ml。
本发明实施例的检测方法，步骤3)的利用流式细胞仪测定酵母浓度，是这样操作的:在分析软件中建立FSC-H/SSC-H散点图，取一管酵母悬液进行上样，调整并确定流式细胞仪的前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)基本参数，FSC采用Line线性形式，SSC采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定酵母范围；每个样品上样Imin，根据圈定的酵母范围，分析酵母个数占总颗粒数的比例，计算Imin读取到的酵母个数，根据酵母浓度计算公式计算酵母浓度，每个样品测定3次以上，计算平均值。本发明实施例的检测方法，所述的酵母浓度计算公式:酵母浓度(个/ml)=lmin读取酵母个数(个/min) +上样速度(ml/min) X稀释倍数。借由上述技术方案，本发明具有的优点和有益效果是:本发明的方法测定量大，准确性高、重复性好、操作简便快速，为酵母浓度的测定提供了方法依据。
图1是实施例1的啤酒酵母FSC-H/SSC-H散点图。 图2是实施例2的啤酒酵母FSC-H/SSC-H散点图。图3是实施例3的啤酒酵母FSC-H/SSC-H散点图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 实施例1使用流式细胞术检测方法测定啤酒发酵过程中的啤酒酵母浓度，包括以下步骤:I)测定流式细胞仪的上样速度:所用流式细胞仪为BD公司生产的，型号为FACSCalibur ;在流式上样管中随机加入1/2-3/4管的蒸馏水，称量管和水总重量，记为初重；然后以慢速进行上样，上样IOmin后立即停止上样，取下上样管，称量管和水总重量，记为末重；根据上样速度计算公式:上样速度(ml/min)=(初重-末重)+水密度(lg/ml) +上样时间(lOmin)，计算流式细胞仪在慢速状态下的上样速度，重复测定5次，计算平均值得到上样速度为0.014ml/min。2)制备酵母悬液:取满罐期的啤酒发酵液，用200目筛网过滤，再用生理盐水稀释10倍后得到酵母悬液，酵母浓度数量级为IO6个/ml (酵母悬液浓度？或其他数值)；3)利用流式细胞仪测定酵母浓度:在CellQuest Pro分析软件中建立FSC-H/SSC-H散点图，如图1所示，取I管酵母悬液进行上样，调整并确定流式细胞仪的基本参数，前向角散射光(FSC)电压E00，放大器2.5，数据采用Line线性形式，侧向角散射光(SSC)电压280，数据采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定酵母范围；每个样品上样lmin，根据圈定的酵母范围，分析酵母个数占总颗粒数的比例，计算Imin读取到的酵母个数，根据酵母浓度计算公式计算酵母浓度，测定3次，计算平均值得到酵母浓度为14.41 X IO6 个/ml。实施例2
使用流式细胞术检测方法测定啤酒发酵过程中的啤酒酵母浓度，包括以下步骤:I)测定流式细胞仪的上样速度:所用流式细胞仪为BD公司生产的，型号为FACSCalibur ;在流式上样管中随机加入1/2-3/4管的蒸馏水，称量管和水总重量，记为初重；然后以慢速进行上样，上样IOmin后立即停止上样，取下上样管，称量管和水总重量，记为末重；根据上样速度计算公式:上样速度(ml/min)=(初重-末重)+水密度(lg/ml) +上样时间(lOmin)，计算流式细胞仪在慢速状态下的上样速度，重复测定5次，计算平均值得到上样速度为0.014ml/min。2)制备酵母悬液:取发酵第一天的啤酒发酵液，用200目筛网过滤，再用生理盐水稀释10倍后得到酵母悬液，酵母浓度数量级为IO6个/ml (酵母悬液浓度？或其他数值)；3)利用流式细胞仪测定酵母浓度:在CellQuest Pro分析软件中建立FSC-H/SSC-H散点图，如图2所示，取I管酵母悬液进行上样，调整并确定流式细胞仪的基本参数，前向角散射光(FSC)电压E00，放大器2.5，数据采用Line线性形式，侧向角散射光(SSC)电压280，数据采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定酵母范围；每个样品上样lmin，根据圈定的酵母范围，分析酵母个数占总颗粒数的比例，计算Imin读取到的酵母个数，根据酵母浓度计算公式计算酵母浓度，测定3次，计算平均值得到酵母浓度为43.72X IO6 个/ml。实施例3使用流式细胞术检测方法测定啤酒发酵过程中的啤酒酵母浓度，包括以下步骤:I)测定流式细胞仪的上样速度:所用流式细胞仪为BD公司生产的，型号为FACSCalibur ;在流式上样管中随机加入1/2-3/4管的蒸馏水，称量管和水总重量，记为初重；然后以慢速进行上样，上样IOmin后立即停止上样，取下上样管，称量管和水总重量，记为末重；根据上样速度计算公式:上样速度(ml/min)=(初重-末重)+水密度(lg/ml) +上样时间(IOmin),计算流式细胞仪在慢速状态下的上样速度，重复测定5次，计算平均值得到上样速度为0.014ml/min。2)制备酵母悬液:取发酵第二天的啤酒发酵液，用200目筛网过滤，再用生理盐水稀释10倍后得到酵母悬液，酵母浓度数量级为IO6个/ml ；3)利用流式细胞仪测定酵母浓度:在CellQuest Pro分析软件中建立FSC-H/SSC-H散点图，如图3所示，取I管酵母悬液进行上样，调整并确定流式细胞仪的基本参数，前向角散射光(FSC)电压E00，放大器2.5，数据采用Line线性形式，侧向角散射光(SSC)电压280，数据采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定酵母范围；每个样品上样lmin，根据圈定的酵母范围，分析酵母个数占总颗粒数的比例，计算Imin读取到的酵母个数，根据酵母浓度计算公式计算酵母浓度，测定3次，计算平均值得到酵母浓度为48.06X IO6 个/ml。将上述实施例1-3的酵母浓度按照计算公式:酵母浓度(个/ml) =Imin读取酵母个数(个/min) +上样速度(ml/min) X稀释倍数(10)，每个样品测定3次，计算平均值。计算结果如下表I和2所示:表I实施例1-3中的流式细胞仪的上样速度检测数据
权利要求
1.一种酵母浓度的流式细胞术检测方法，其特征在于其包括以下步骤: 1)测定流式细胞仪的上样速度； 2)制备 酵母悬液； 3)利用流式细胞仪测定酵母浓度。
2.根据权利要求1所述的酵母浓度的流式细胞术检测方法，其特征在于:步骤I)的测定流式细胞仪的上样速度，是这样操作的: 在流式上样管中加入一定的蒸馏水，称量管和水总重量，记为初重；然后以慢速进行上样，上样一定时间后立即停止上样，取下上样管，称量管和水总重量，记为末重；根据上样速度计算公式计算流式细胞仪在慢速状态下的上样速度，重复测定5次以上，计算平均值。
3.根据权利要求2所述的酵母浓度的流式细胞术检测方法，其特征在于:所述上样速度其计算公式为: 上样速度(ml/min)=(初重-末重)+水密度(lg/ml) +上样时间(min)。
4.根据权利要求1所述的酵母浓度的流式细胞术检测方法，其特征在于:步骤2)中，制备酵母悬液的方式是:取酵母液，用200目筛网过滤，再用酵母培养液或蒸馏水调整酵母浓度后得到酵母悬液。
5.根据权利要求4所述的酵母浓度的流式细胞术检测方法，其特征在于:所述酵母悬液，其中酵母浓度的数量级优选IO6个/ml。
6.根据权利要求1所述的酵母浓度的流式细胞术检测方法，其特征在于:步骤3)所述的利用流式细胞仪测定酵母浓度，是这样操作的: 在分析软件中建立FSC-H/SSC-H散点图，取I管酵母悬液进行上样，调整并确定流式细胞仪的前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)基本参数，FSC采用Line线性形式，SSC采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定酵母范围；每个样品上样lmin，根据圈定的酵母范围，分析酵母个数占总颗粒数的比例，计算Imin读取到的酵母个数，根据酵母浓度计算公式计算酵母浓度，每个样品测定3次以上，计算平均值。
7.根据权利要求1所述的酵母浓度的流式细胞术检测方法，其特征在于:所述的酵母浓度计算公式:酵母浓度(个/ml) =Imin读取酵母个数(个/min) +上样速度(ml/min) X稀释倍数。
全文摘要
本发明公开了一种酵母浓度的流式细胞术检测方法，包括步骤1)测定流式细胞仪的上样速度；2)制备酵母悬液；3)利用流式细胞仪测定酵母浓度。在FSC-H/SSC-H散点图上圈定酵母范围；每个样品上样1min，根据圈定的酵母范围，分析酵母个数占总颗粒数的比例，计算1min读取到的酵母个数，根据酵母浓度计算公式计算酵母浓度。本发明的方法测定量大，准确性高、重复性好、操作简便快速，为酵母浓度的测定提供了方法依据。
文档编号G01N15/14GK103234892SQ20131012437
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者张秀霞, 熊丹, 李惠萍, 蔡红远, 张宇锋 申请人:广州南沙珠江啤酒有限公司, 广州珠江啤酒股份有限公司