一种利用DGGE鉴定混合中药粉末组成物种的方法与流程

本发明涉及混合中药粉末的基因鉴别技术。尤其是植物类混合中药粉末组成物种分析。

背景技术：

目前中药材鉴定方法除传统的外观、理化鉴定方法外，还包括DNA条形码鉴别方法，该技术可通过基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定，具有快速、准确、重复性高等优点，被广泛用于药用植物的物种鉴定工作中。中国中医研究院中药研究所经过十来年的积累，完成了8000余种中草药及其混伪品的DNA条形码研究，创建了“中草药DNA条形码生物鉴定体系”，实现中药资源信息检索、查询以及基因序列的比对鉴定，从基因水平解决中药材与混伪品的物种识别问题。但其技术缺陷在于：DNA条形码仅适用于单味中药的基因鉴别，无法分析混合了多物种的材料，如中药粉末混合物。

其次是第二代测序技术(Next-generation sequencing,NGS)，该技术可以同时对数十万乃至数百万条DNA进行测序，被称为高通量测序。它可以全面、深入和细致地分析一种生物的组织或细胞的基因组、转录组，因此又被称为深度测序，具有高准确性，高通量，高灵敏度。有学者利用第二代测序技术对六味地黄丸进行了组成物种分析，成功地鉴定出六种组成成分。技术缺陷：第二代测序需使用高端的测序仪，测序所得数据需要具备生物信息工程学的专业知识才能进行分析，技术门槛高，而且价格昂贵，不易推广使用。对于组分过多，特别是多于六种成分的中药混合物或制剂的鉴定效果，仍未确定。

而DGGE技术是一种基因突变检测手段，系通过变性梯度凝胶电泳来分离鉴别基因突变，理想的实验条件可以鉴别出DNA片段中单个碱基突变。DGGE的技术原理是基于在变性梯度凝胶中DNA的解链行为差异导致DNA的迁移速度差异，从而达到分离野生型与突变型DNA片段的目的。利用微生物通用的16S rRNA作为标记物，DGGE技术常被用于检测微环境生物样品中的微生物多样性，分离结果以凝胶上的电泳条带呈现，非常直观，可以达到初步的定性和定量目的。DGGE分析被广泛地应用于土壤、沿海环礁湖表层沉积物、牛奶、人类口腔、肠道(或肠容物)等微环境中的微生物多样性分析中。目前尚未有将DGGE技术应用于混合中药粉末鉴定的报道，因此，也未有用于混合中药粉末DGGE分析的合适标记物。

技术实现要素：

为克服以上缺陷，本发明提供了一种分析混合中药粉末组成物种的分析方法。该方发将DNA条形码与DGGE技术结合，为解决混合中药粉末或复方制剂的组成物种鉴定问题和中药掺伪鉴别提供了新的途径。

本发明的技术方案包括以下步骤：

1、基因组DNA的提取：用试剂盒法或改良CTAB法提取混合中药粉末样品的基因组DNA；

2、选择及改造引物：选择DNA条形码相应的通用引物；并在引物对中正向引物的5`端加上特异性的GC发卡结构，所述的发卡结构长度40bp，序列为5`-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3`，得特异性引物；

3、第一轮PCR扩增:以步骤(1)所得的基因组DNA作为模板，以步骤2所得的引物进行PCR扩增；

4、DGGE分析：将所得PCR扩增产物用于DGGE分析，在变性凝胶中电泳分离；电泳分离结束后，将变性凝胶染色，并置于凝胶成像仪中做成像检测，得到DGGE变性凝胶电泳条带；

5、DNA凝胶回收及第二轮PCR扩增：在所得的DGGE变性凝胶电泳条带上切取单一DNA条带，回收DNA，并利用步骤2的引物进行第二轮PCR扩增；

6、测序和数据分析：将步骤5所得的PCR扩增产物直接用于DNA测序；所得DNA序列进行序列拼接、裁切，并提交至公共数据库进行序列比对，以最高的序列相似度物种为鉴定结果，区分混合中药粉末物种组成。

步骤2所述的通用引物优选为ITS2或trnL。其中，通用引物ITS2，正向引物为：ITS2_2F(5`-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3`)，反向引物为：ITS2_3R(5`-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3`)，在正向引物5`端加上GC发卡结构，得特异性引物：GCITS2_2F(5`-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3`)。通用引物trnL，特异性正向引物为：GCtrnL_F(5`-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCGAAATCGGTAGACGCTACG-3`)；反向引物为：trnL_R(5`-CCATTGAGTCTCTGCACCTATC-3`)。

步骤3的PCR扩增体系可选用Taq酶，反应程序可为：94℃，2min；94℃，30s，52℃，20s，72℃，50s，35个循环；72℃，5min；扩增后用1％琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(540bp左右)出现清晰条带为阳性。

所述步骤5，DGGE分析所用的变性凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，变性剂含有为尿素和甲酰胺，变性凝胶染色剂为溴化乙锭溶液。优选，变性凝胶浓度为6％-10％，变性剂的浓度范围为30％-80％；电泳条件为：电压80-200V，60℃下电泳5-12h变性凝胶染色剂的浓度为400mL 0.5μg/mL，染色时间25min。

本发明融合了DNA条形码与DGGE技术，弥补了DNA条形码不能鉴定混合中药粉末的缺陷，成功地将DGGE技术应用于中药混合物的鉴定，有效地解决了混合中药粉末或复方制剂的组成物种鉴定和中药掺伪鉴别的问题。该方法适用于物种组分8种以上混合中药粉末的鉴别。另外，本发明的新方法不需涉及专业的生物信息学分析，也不需使用高端昂贵的高通量测序，有效降低了技术门槛和实验成本。该方法具有快速、准确、重复性高、成本低等优点。

附图说明

图1是实施例1的第一轮PCR扩增产物电泳图；

图2是实施例1的DGGE分析结果图；

图3是实施例1的第二轮PCR扩增产物电泳图；

图4是实施例2的第一轮PCR扩增产物电泳图；

图5是实施例2的DGGE分析结果图；

图6是实施例2的第二轮PCR扩增产物电泳图；

图7是实施例3的第一轮PCR扩增产物电泳图；

图8是实施例3的DGGE分析结果图；

图9是实施例3的第二轮PCR扩增产物电泳图；

图10是实施例4的第一轮PCR扩增产物电泳图；

图11是实施例4的DGGE分析结果图；

图12是实施例4的第二轮PCR扩增产物电泳图。

具体实施方式

下面通过实施案例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1：玉屏风散处方混合中药粉末的鉴定

1选取并制备样品

以玉屏风散(药物组成：黄芪、防风、白术)为例，每味药材单独粉碎成细粉，等重混合均匀，作为实验样品。

2基因组DNA的提取(改良CTAB法)

称取样品100mg，置于2.0mL离心管中，加入2颗Φ5mm的灭菌钢珠，用生物样品均质仪以6.0m/s震荡30s，重复震荡2次，每次间隔30s。向离心管中加入1000μL CTAB free缓冲液(100mMTris-HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl)，剧烈震荡，旋转混匀5min，1,3000rpm离心3min，弃上清液；重复该步骤1-2次。向离心管中加入800μL CTAB缓冲液(3％CTAB，100mMTris-HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl)，充分震荡混匀，65℃金属浴中孵育3h，期间每隔10min左右颠倒混匀数下。加入600μL氯仿-异戊醇(24:1，v:v)，充分震荡混匀，静置5min，1,3000rpm离心15min，小心吸取上清于新的1.5mL离心管中。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，-20℃放置10min，1,3000rpm离心15min，弃上清。加800μL-20℃预冷的75％乙醇，上下颠倒混匀数次，1,3000rpm离心15min，重复1次。弃尽上清，打开离心管盖子室温晾干5min，加入50μL 65℃预热的ddH₂O，小心吹打沉淀，将可溶部分转移至新的离心管中，即得样品的基因组DNA。

3引物的选取和改造

选取DNA条形码通用引物ITS2，其中正向引物：ITS2_2F(5`-ATGCGATACT TGGTGTGAAT-3`)和反向引物：ITS2_3R(5`-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3`)。在正向引物的5`端加上GC发卡结构，得到GC夹正向引物：GCITS2_2F(5`-CG CCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3`)。

4第一轮PCR扩增

PCR体系：2×Power Taq PCR MasterMix12.5μL，引物GCITS2_2F和ITS2_3R各1.0μL，步骤2所得的基因组DNA 2.0μL，ddH₂O补足体积至25.0μL。反应程序：94℃，2min；94℃，30s，52℃，20s，72℃，50s，35个循环；72℃，5min。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(540bp左右)出现清晰条带为阳性。结果如图1所示。

5DGGE分析

将上述PCR产物用于DGGE分析，所用仪器为DCode基因突变检测系统(Bio-Rad)。分析所用的凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，含有尿素和甲酰胺为变性剂，凝胶浓度为6％，变性剂的浓度范围为40％-60％。电泳条件为80V，60℃下电泳12h。电泳结束后，将凝胶置于400mL 0.5μg/mL的溴化乙锭溶液中染色25min。取出凝胶，置于BDAdigital(Biomatra)凝胶成像仪中做成像检测。结果如图2所示。

6DNA凝胶回收

用解剖刀将上述凝胶中每个独立的条带切出来，称重，置于1.5mL离心管中。按所切出的凝胶重量的3倍体积加入Binding Buffer，55℃孵育5min，期间每隔1min取出离心管并颠倒数次。加入5μL Silica Powder Suspension，混匀后55℃孵育5min，期间每隔1min取出离心管并颠倒数次。1,3000rpm离心30s，小心弃去上清。加入500μL Washing Buffer，震荡使沉淀重新混悬，1,3000rpm离心30s，小心弃去上清，重复洗涤一次。快速离心5s，用移液枪吸走残留液体，室温晾干10-15min。加入50μL ddH₂O，震荡使沉淀重新混悬，室温孵育5min，1,3000rpm离心30s，吸取上清，即得DNA回收液。

7第二轮PCR扩增

PCR体系：2×Power Taq PCR MasterMix12.5μL，引物ITS2_2F和ITS2_3R各1.0μL，DNA模板2.0μL，ddH₂O补足体积至25.0μL。温度程序：94℃，2min；94℃，30s，52℃，20s，72℃，50s，35个循环；72℃，5min。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(500bp左右)出现清晰条带为阳性。结果如图3所示。

8测序和数据分析

将上述第二轮的阳性PCR产物送检测序。测序得到的数据经过序列拼接、裁切，得到ITS2片段约220bp。将该片段提交至基因库(Genbank)与中药材DNA条形码鉴定系统，与公共数据库中的数据做序列比对，进而得出物种鉴定结果。序列比对结果见表1。

表1

实施例2：人参、三七、北沙参和桔梗混合中药粉末的鉴定(以ITS2为普通引物)

1、选取并制备样品

以人参、三七、北沙参和桔梗为例，每味药材单独粉碎成细粉，等重混合均匀，作为实验样品。

2、基因组DNA的提取(改良CTAB法)

称取样品100mg，置于2.0mL离心管中，加入2颗Φ5mm的灭菌钢珠，用生物样品均质仪以6.0m/s震荡30s，重复震荡2次，每次间隔30s。向离心管中加入1000μL CTAB free缓冲液(100mMTris-HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl)，剧烈震荡，旋转混匀5min，1,3000rpm离心3min，弃上清液；重复该步骤1-2次。向离心管中加入800μL CTAB缓冲液(3％CTAB，100mMTris-HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl)，充分震荡混匀，65℃金属浴中孵育3h，期间每隔10min左右颠倒混匀数下。加入600μL氯仿-异戊醇(24:1，v:v)，充分震荡混匀，静置5min，1,3000rpm离心15min，小心吸取上清于新的1.5mL离心管中。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，-20℃放置10min，1,3000rpm离心15min，弃上清。加800μL-20℃预冷的75％乙醇，上下颠倒混匀数次，1,3000rpm离心15min，重复1次。弃尽上清，打开离心管盖子室温晾干5min，加入50μL 65℃预热的ddH₂O，小心吹打沉淀，将可溶部分转移至新的离心管中，即得样品的基因组DNA。

3、引物的选取和改造

选取DNA条形码通用引物ITS2，其中正向引物：ITS2_2F(5`-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3`)和反向引物：ITS2_3R(5`-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3`)。在正向引物的5`端加上GC发卡结构，得到GC夹正向引物：GCITS2_2F(5`-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3`)。

4、第一轮PCR扩增

PCR体系：2×Power Taq PCR MasterMix12.5μL，引物GCITS2_2F和ITS2_3R各1.0μL，步骤2所得的基因组DNA 2.0μL，ddH₂O补足体积至25.0μL。反应程序：94℃，2min；94℃，30s，52℃，20s，72℃，50s，35个循环；72℃，5min。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(540bp左右)出现清晰条带为阳性。结果如图4所示。

5、DGGE分析

将上述PCR产物用于DGGE分析，所用仪器为DCode基因突变检测系统(Bio-Rad)。分析所用的凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，含有尿素和甲酰胺为变性剂，凝胶浓度为6％，变性剂的浓度范围为40％-60％。电泳条件为80V，60℃下电泳12h。电泳结束后，将凝胶置于400mL 0.5μg/mL的溴化乙锭溶液中染色25min。取出凝胶，置于BDAdigital(Biomatra)凝胶成像仪中做成像检测。结果如图5所示。

6、DNA凝胶回收

用解剖刀将上述凝胶中每个独立的条带切出来，称重，置于1.5mL离心管中。按所切出的凝胶重量的3倍体积加入Binding Buffer，55℃孵育5min，期间每隔1min取出离心管并颠倒数次。加入5μL Silica Powder Suspension，混匀后55℃孵育5min，期间每隔1min取出离心管并颠倒数次。1,3000rpm离心30s，小心弃去上清。加入500μL Washing Buffer，震荡使沉淀重新混悬，1,3000rpm离心30s，小心弃去上清，重复洗涤一次。快速离心5s，用移液枪吸走残留液体，室温晾干10-15min。加入50μL ddH₂O，震荡使沉淀重新混悬，室温孵育5min，1,3000rpm离心30s，吸取上清，即得DNA回收液。

7、第二轮PCR扩增

PCR体系：2×Power Taq PCR MasterMix12.5μL，引物ITS2_2F和ITS2_3R各1.0μL，DNA模板2.0μL，ddH₂O补足体积至25.0μL。温度程序：94℃，2min；94℃，30s，52℃，20s，72℃，50s，35个循环；72℃，5min。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(500bp左右)出现清晰条带为阳性。结果如图6所示。

8、测序和数据分析

将上述第二轮的阳性PCR产物送检测序。测序得到的数据经过序列拼接、裁切，得到ITS2片段约220bp。将该片段提交至基因库(Genbank)与中药材DNA条形码鉴定系统与公共数据库中的数据做序列比对，进而得出物种鉴定结果。序列比对结果见表2。

表2

实施例3：人参、三七、北沙参和桔梗混合中药粉末的鉴定(以trnL为普通引物)

将实施例2中的引物以trnL代替，PCR扩增体系为：Taq DNA酶预混液12.5μL，引物GCtrnL_F(5`-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCGAAATCGGTAGACGCTACG-3`)和反向引物：trnL_R(5`-CCATTGAGTCTCTGCACCTATC-3`)各1.0μL，步骤2所得的基因组DNA 2.0μL，ddH₂O补足体积至25.0μL。反应程序：95℃，2min；95℃，30s，50℃，30s，72℃，50s，40个循环；72℃，5min。所得的第一轮PCR扩增产物电泳图如图7所示；DGGE分析结果图如图8所示；第二轮PCR扩增产物电泳图如图9所示。结果经基因库比对相似度均为100％。

实施4：丹参、党参、红景天、决明子、罗布麻叶、当归、菊花和玫瑰花8种组份混合中药粉末的鉴定。

1、选取并制备样品

以丹参、党参、红景天、决明子、罗布麻叶、当归、菊花、玫瑰花8个样品为例，每味药材单独粉碎成细粉，等重混合均匀，作为实验样品。

2、基因组DNA的提取(改良CTAB法)

称取样品100mg，置于2.0mL离心管中，加入2颗Φ5mm的灭菌钢珠，用生物样品均质仪以6.0m/s震荡30s，重复震荡2次，每次间隔30s。向离心管中加入1000μL CTAB free缓冲液(100mMTris-HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl)，剧烈震荡，旋转混匀5min，1,3000rpm离心3min，弃上清液；重复该步骤1-2次。向离心管中加入800μL CTAB缓冲液(3％CTAB，100mMTris-HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl)，充分震荡混匀，65℃金属浴中孵育3h，期间每隔10min左右颠倒混匀数下。加入600μL氯仿-异戊醇(24:1，v:v)，充分震荡混匀，静置5min，1,3000rpm离心15min，小心吸取上清于新的1.5mL离心管中。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，-20℃放置10min，1,3000rpm离心15min，弃上清。加800μL-20℃预冷的75％乙醇，上下颠倒混匀数次，1,3000rpm离心15min，重复1次。弃尽上清，打开离心管盖子室温晾干5min，加入50μL 65℃预热的ddH₂O，小心吹打沉淀，将可溶部分转移至新的离心管中，即得样品的基因组DNA。

3、引物的选取和改造

选取DNA条形码通用引物ITS2，其中正向引物：ITS2_2F(5`-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3`)和反向引物：ITS2_3R(5`-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3`)。在正向引物的5`端加上GC发卡结构，得到GC夹正向引物：GCITS2_2F(5`-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3`)。

4、第一轮PCR扩增

PCR体系：2×Power Taq PCR MasterMix12.5μL，引物GCITS2_2F和ITS2_3R各1.0μL，步骤2所得的基因组DNA 2.0μL，ddH₂O补足体积至25.0μL。反应程序：94℃，2min；94℃，30s，52℃，20s，72℃，50s，35个循环；72℃，5min。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(540bp左右)出现清晰条带为阳性。结果如图10所示。

5、DGGE分析

将上述PCR产物用于DGGE分析，所用仪器为DCode基因突变检测系统(Bio-Rad)。分析所用的凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，含有尿素和甲酰胺为变性剂，凝胶浓度为6％，变性剂的浓度范围为40％-60％。电泳条件为80V，60℃下电泳12h。电泳结束后，将凝胶置于400mL 0.5μg/mL的溴化乙锭溶液中染色25min。取出凝胶，置于BDAdigital(Biomatra)凝胶成像仪中做成像检测。结果如图11所示。

6、DNA凝胶回收

用解剖刀将上述凝胶中每个独立的条带切出来，称重，置于1.5mL离心管中。按所切出的凝胶重量的3倍体积加入Binding Buffer，55℃孵育5min，期间每隔1min取出离心管并颠倒数次。加入5μL Silica Powder Suspension，混匀后55℃孵育5min，期间每隔1min取出离心管并颠倒数次。1,3000rpm离心30s，小心弃去上清。加入500μL Washing Buffer，震荡使沉淀重新混悬，1,3000rpm离心30s，小心弃去上清，重复洗涤一次。快速离心5s，用移液枪吸走残留液体，室温晾干10-15min。加入50μL ddH₂O，震荡使沉淀重新混悬，室温孵育5min，1,3000rpm离心30s，吸取上清，即得DNA回收液。

7、第二轮PCR扩增

PCR体系：2×Power Taq PCR MasterMix12.5μL，引物ITS2_2F和ITS2_3R各1.0μL，DNA模板2.0μL，ddH₂O补足体积至25.0μL。温度程序：94℃，2min；94℃，30s，52℃，20s，72℃，50s，35个循环；72℃，5min。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(500bp左右)出现清晰条带为阳性。结果如图12所示。

8、测序和数据分析

将上述第二轮的阳性PCR产物送检测序。测序得到的数据经过序列拼接、裁切，得到ITS2片段约220bp。将该片段提交至基因库(Genbank)与中药材DNA条形码鉴定系统，与公共数据库中的数据做序列比对，进而得出物种鉴定结果。序列比对结果见表3。

表3

在试验中，发明人尝试使用其他的改造引物进行试验，但没有获得清晰度分离度符合试验要求的结果。