本发明属于生物技术领域，涉及一种口腔拭子核酸保存方法。
背景技术：
口腔拭子是分子流行病学、遗传学和法医学研究中重要的核酸来源，其收集具有取样简便、安全、成本低、无创伤的优点。低温保存对核酸的冷打击使其在保存后不能取得理想的保存效果，高温保存核酸又会使能量代谢加剧、细菌的繁殖速度加快，致使核酸在短时间内就表现衰退死亡现象。经过研究表明口腔拭子核酸最佳保存温度在25℃-45℃。，而现今的保存方法效果不佳，因此，需要一种保存方法能满足常温长时间的目的。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明要解决的技术问题是提供一种常温、长时间的口腔拭子核酸保存方法；
本发明的内容为：一种口腔拭子核酸常温保存方法，其特征在于，可以在25度至45度的常温下保存6个月，具体步骤如下：
第一步，检测待保存的口腔拭子核酸的质量；
口腔拭子核酸样品完整率和畸形率检测，先准备洁净的载波片，用洗涤灵擦洗，清水冲洗，再用蒸馏水漂洗，以不挂水珠为净，烘干或晾干备用，抹片：将需测定的样品摇匀，取滴中层样品平滴于载玻片的右端，取另一张边缘光滑平直的载玻片，呈35°角自口腔拭子核酸样品的左面向右接触样品，样品即呈条状分布在两个载玻片接触边缘之间，将上面的载玻片贴着平置的载玻片表面，自右向左移动，带着样品均匀地分布在载玻片上，在制作的抹片背面右端用特种记号笔编号，每份样品需同时制作两个抹片，自然风干5～20min。固定：将风干的抹片平置于染色架上，用滴管吸取1ml固定液，滴于抹片上，并使固定液布满于整个抹片表面，并固定15min。水洗：用载玻片镊子夹住抹片一端， 将固定液弃去倒入染色缸或平皿内，在装有蒸馏水的烧杯中，上下左右摇晃涮洗，夹住松开镊子几次，取出抹片于磁盘边，待干。染色：将固定后的抹片平置于染色架上，用滴管吸取新配制Giemsa染液约2ml，置于要染的载玻片上方平行。自左至右挤出染液于抹片上，使染液均匀布满在抹片上。静止染色90min。水洗：用镊子夹住染片，将染片上的染液弃去倒入平皿内，再在装有自来水的烧杯中冲洗，冲洗方法同上。经数次涮洗，直至水洗液无色为止。洗的过程中，若水已变蓝，则可及时换清水。洗净后可立于磁盘边，待干。将染片在检测仪器中，检测质量，只有满足事先规定质量的口腔拭子核酸的质量才能进行下一步的常温保存，该质量为核酸在口腔拭子中含量为65％以上；
第二，进行口腔拭子核酸的常温保存；稀释液pH总体变化为先下降，后上升，最后趋于稳定。分析其原因为，核酸细胞是不断新陈代谢的，在这一过程中会产生酸性代谢产物，这种酸性代谢产物使得pH下降。因为稀释剂配方中有柠檬酸钠、Tris、碳酸氢钠等缓冲剂，可平衡核酸代谢产物维持核酸生存环境的相对稳定，同样起到保护核酸的作用。分别按口腔拭子核酸与稀释液比例为1∶1、1∶1.5、1∶21∶2.5、1∶3五种比例稀释，测定核酸活力变化，以确定最佳稀释比例。1∶1、1∶1.5，1∶2三种比例的保存效果好，在1∶1，1∶1.5，1∶2三种比例中1∶1，1∶1.5两种比例的保存效果略好，差异不显著(P＞0.05)。1∶2.5，1∶3两种比例的保存效果近似(P＞0.05)，但不如上述三种。综合考虑，选用1∶1.5作为常温保存的稀释液；
抗生素的添加是口腔拭子核酸常温保存过程中的重点，抗生素的作用是抑制稀释液中细菌的滋生，为精子细胞提供健康环境。本试验的结果表明，青霉素的效果不如庆大霉素，而青霉素+庆大霉素的混合剂效果最佳，选用这种混合剂；
温度是影响口腔拭子核酸常温保存外界因素的代表，早起对于口腔拭子核酸常温保存的适宜温度的研究中，人们认为低温可以抑制核酸的活性，从而达到延长保存时间的目的。而大量的实验研究表明，低温对于口腔拭子核酸细胞的影响很大，会导致口腔拭子核酸细胞的失活，也就谈不上口腔拭子核酸的保 存了。最近研究表明，在25度至45度条件下，对于口腔拭子核酸的保存效果最好，其中普遍认可的是30℃室温条件是常温保存最好的温度。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内。具体方法如下：
稀释液是影响口腔拭子核酸常温保存效果的关键因素，稀释液的主要作用是：一方面用于扩大核酸体积以满足生产需求；另一方而保护核酸的功能特征。稀释液中所含的各种成分对口腔拭子核酸的保护作用也各不相同，核酸需要产生能量以维持细胞代谢和自身运动。葡萄糖不仅能为核酸提供能量，还可以维持稀释液的渗透压，在绝大多数配方中使用。过酸过碱的环境都不利于核酸生存，稀释液中需要添加一定量的缓冲物质以维持核酸pH。碳酸氢钠或柠檬酸钠常被用来调节稀释液的pH，Tris和HEPES等缓冲剂的缓冲能力更强。EDTA是一种螯合剂，能够与稀释液中的金属离子尤其是Ca2+结合，减少进入细胞内的Ca2+，防止诱发核酸获能和顶体反应的发生，以达到抑制核酸活动，增加核酸保存时间的效果。一定浓度的+能维持核酸膜上Na+-K+泵运转，但必须保证核酸细胞内的K+浓度高于细胞外的K浓度，这样才能产生ATP维持核酸的存和运动，因而稀释液可添加适量的KC1。另外，稀释液中添加抗生素可以抑制细菌的繁殖，主要的常用的抗生素有青霉素，庆大霉素等。但由于现代社会对于抗生素的滥用，使得很多细菌对于常用抗生素有着明显的抗性，所以，新型的抗生素适用于口腔拭子核酸常温保存的研究已经迫在眉睫。
口腔拭子核酸单独的保存，其中的有害微生物不仅会争夺营养物质，而且代谢产生的有毒代谢废物会改变保存环境，严重影响保存效果。现存在的菌类有大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯菌、变形杆菌、和棒状杆菌等。革兰氏阴性菌为公猪精液中常见的菌类。因此在稀释剂中添加对革兰氏阴性菌有抑制效果的 抗生素最佳。在稀释液中添加庆大霉素来抑制细菌的生长，对细胞的不良作用小。在稀释液中添加0.2mg/ml的聚维酮碘能够杀死致病细菌，且对精液常温保存质量指标无影响。有研究者在对不同来源的口腔拭子进行细菌分离、鉴定、培养及药敏试验时发现，检出的五种细菌中，环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星等奎若酮类药物对其抑制效果较好，且发现变形杆菌、棒状杆菌和沙门氏菌对青霉素和克林霉素具有耐药性。比较了7抗生素及组合对水牛精液中细菌的抑菌效果，结果显示，青霉素、链霉素和庆大霉素全部具有抗菌圈，而泰乐菌素、林肯霉素、新霉素和大观霉素有不同程度的耐药现象。在抗生素组合方面庆泰林大的抗生素组合最佳。实际应用中，抗生素的选择会因稀释剂成分的不同而不同。
本发明的有益效果是：本发明的优点为操作简单、考虑全面，在常温口腔拭子核酸的保存中，控制了保存的温度区间及保存的时间长度，能更好地应用到实际情况中。