本发明涉及生物工程技术领域，具体地涉及一种高密度培养固氮细菌的方法及其应用。
背景技术：
所谓生物碳，是由有机垃圾，如动物粪便，动物骨头，植物根茎，木屑和麦秸秆等生物量经过热化学效应，被高温分解，成为可用做肥料的类似于碳球状的物质。其中由植物形成的，以固定碳元素为目的的木炭被称为“生物碳”。土地中自然存在大量的碳元素，但是这些碳是不稳定的，受气候影响会释放二氧化碳。而生物碳则可以固定碳元素长达几百年。
生活在巴西亚马逊河流域的人们长期使用一种特殊的肥料。这种肥料来源于当地，具有极强的恢复贫瘠土壤肥力的能力。当地人把它称为“印第安人的黑土壤”。它多产、肥沃，与当地稀疏、贫瘠的土壤形成鲜明的对比。现代研究证明，黑土壤是2500年，甚至6000年以前由生活在亚马逊流域的人们制造的。一般认为，他们使用的材料包括动物粪便，鱼，动物骨头和植物废物。但是生产黑土壤最关键的原料，也是黑土壤之所以呈现黑色的原因，是木炭的使用。黑土壤中的木炭可以使土壤肥力维持一个世纪之久。几个世纪以来，生活在南美亚马逊流域的人们都靠这些原生态材料制造“黑土壤”来肥沃土地。几千年过去了，那儿的土壤不需耕耘灌溉，依旧十分肥沃。佐治亚大学的科学家Steiner解释道：“千百年过去，这个区域依旧沃土依然，那是因为土壤中富含碳元素”。因此，生物碳使人们看到了无需砍伐森林也可开拓农耕地的希望。
生物碳可以保护环境。鉴于其高含碳量和多孔的特性，它不仅可提高土壤蓄水储养的能力，还可保护土壤中的微生物。它像一个地下碳水槽，锁住二氧化碳，最终达到增加作物产量的效果。生物碳可吸收有机物质腐烂时释放至大气的二氧化碳，并帮助植物有效储存其光合作用所需的二氧化碳。通过这两种方式，生物碳起到了洁净空气的作用，是面向未来的、低成本的、可持续性的环保能源。
固氮菌为细菌的一科。菌体杆状、卵圆形或球形，无内生芽孢，革兰氏染色阴性，严格好氧性，属于有机营养型，能固定空气中的氮元素。包括共生固氮菌和自生固氮菌。
共生固氮菌在与植物共生的情况下才能固氮或才能有效地固氮，固氮产物氨可直接为共生体提供氮源。主要有根瘤菌属(Rhizobium)的细菌与豆科植物共生形成的根瘤共生体。根瘤菌生活在土壤中，以动植物残体为养料，过着“腐生生活”。当土壤中有相应的豆科植物生长时，根瘤菌迅速向它根部靠拢，从根毛弯曲处进入根固氮菌部。豆科植物根部在根瘤菌的刺激下迅速分裂膨大，形成“瘤子”，为根瘤菌提供了理想的活动场所，还供应了丰富的养料，让根瘤菌生长繁殖。根瘤菌又会从空气中吸收氮气，为豆科植物制作氮源，促进植物生长。因此根瘤菌也被称为共生固氮菌。根瘤菌固定的氮源不仅满足豆科植物的需要，还可以积累氮源满足后续植物生长。还有一些固氮菌，如圆褐固氮菌，它们不在植物体内，能自己从空气中吸收氮气，繁殖后代，死后将菌体固定的氮源提供给植物，让植物得到大量氮肥。这类固氮菌叫自生固氮菌。固氮菌肥料是利用固氮微生物将大气中的分子态氮气转化为农作物能利用的氨，进而为其提供合成蛋白质所必需的氮素营养的肥料。微生物自生或与植物共生，将大气中的分子态氮气转化为农作物可吸收的氨的过程，称为生物固氮。生物固氮是在极其温和的常温常压条件下进行的生物化学反应，不需要化肥生产中的高温、高压和催化剂，因此，生物固氮是最便宜、最干净、效率最高的施肥过程。固氮菌肥料是最理想的、最有发展前途的肥料。
目前固氮菌肥料的生产基本上采用液体发酵的方法，产品可分液体菌剂和固体菌剂。在发酵罐发酵结束后及时分装即成液体菌剂，发酵好的液体再用灭菌的草炭等载体吸附剂进行吸附即成固体菌剂。固氮菌肥料是含有固氮菌大量好气性自身固氮菌的微生物肥料。自身固氮菌不与高等植物共生，没有寄主选择，而是独立生存于土壤中，利用土壤中的有机质或根系分泌的有机物作碳源来固定空气中的氮素，或直接利用土壤中的无机氮化合物。固氮菌肥对棉花、水稻、小麦、花生、油菜、玉米、高粱、马铃薯、烟草、甘蔗以及各种蔬菜都有一定增产作用。
现有高密度培养技术通常是通过外加设备，通过截留或连续培养获得，这些技术不仅易污染，而且菌体浓度不高。
技术实现要素：
1、要解决的问题
针对上述现有技术的问题，本发明提供一种利用生物碳吸附，无需外加设备，而且可以实现分批高密度培养的方法，通过该方法培养硅酸盐菌体密度可以达到1×1013～1×1015cfu/mL。
2、技术方案
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明中一种高密度培养固氮细菌的方法，所述制备方法以生物碳作为吸附载体，以固氮细菌作为出发菌株，依次经过试管扩大培养、液体摇瓶培养和种子罐扩大培养、液体发酵培养等步骤；发酵液菌体浓度为1×1013～1×1015cfu/mL。所制备的发酵液可以经过离心喷雾干燥，干燥的菌体粉活菌量达1015～1017cfu/g。
所述的一种高密度培养固氮细菌的方法，该方法所使用的生物碳原料可以是污泥、动物粪便、动物骨头、植物根茎和木屑等生物量经过热化学效应，被高温分解得到的任意一种生物碳；所使用的固氮细菌菌种为褐球固氮菌、固氮菌、内生固氮菌、大豆根瘤菌、花生根瘤菌中任一种。
进一步地，所述的一种高密度培养固氮细菌的方法，其包括如下步骤：
A1试管扩大培养：将固氮细菌斜面菌种接种于固氮细菌斜面培养基中进行培养，制得固氮细菌试管斜面菌种；
A2液体摇瓶培养：将步骤A1所制得的固氮细菌试管斜面菌种接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，进行培养，制得固氮细菌液体摇瓶菌种；
A3种子罐扩大培养：将步骤A2所制得的固氮细菌液体摇瓶菌种接种到种子罐培养基中进行培养，制成固氮细菌种子罐菌种；
A4液体发酵培养：将步骤A3所制得的固氮细菌种子罐菌种接种到液体发酵培养基中，并混合均匀，进行发酵培养，制得固氮细菌发酵液；
A5干燥与包装：固氮细菌发酵液经过离心、喷雾干燥、包装制得固氮细菌干粉。
进一步地，所述的一种高密度培养固氮细菌的方法，其具体步骤为：
B1试管扩大培养：接种一环固氮细菌斜面菌种到固氮细菌试管斜面培养基中，25～40℃培养2～10天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；
B2液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有20～150mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为10～160转/分，温度25～40℃的条件下，摇床培养18～86h，制成固氮细菌液体摇瓶菌种；
B3种子罐扩大培养：将步骤B2所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为0.2～10％的接种量接种，在温度为25～40℃，搅拌转速为10～120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2～1.8:1的通气量条件下，培养18～96h，制成固氮细菌种子罐菌种；
B4液体发酵培养：将步骤B3所制得的固氮细菌种子罐菌种按体积比为0.2～10％接种量接入液体发酵培养基中，在温度25～40℃，搅拌转速为10～120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2～1.8:1的通气量条件下，培养48～96小时，制得固氮细菌发酵液，该发酵液菌体浓度为1013～1015cfu/mL；
B5干燥与包装：将步骤B4所制得的固氮细菌发酵液4000～10000转/分钟离心10～30分钟，调节菌体浓度为1014～1016cfu/mL，进风温度110～120℃，进样速度600～800mL/h，雾化压力0.08～0.2MPa，热风流量20～40M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015～1017cfu/g；
优选地，步骤B2中所述液体摇瓶培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖5～20g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，牛肉浸膏1～10g，生物碳3～30克。
优选地，步骤B3中所述种子罐扩大培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升种子罐培养基中含有蔗糖5～20g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，牛肉浸膏1～10g生物碳3～30克。
优选地，步骤B4中所述发酵培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖10～50g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，酵母浸膏3～20g，植物油2～8g，生物碳5～50克。
本发明还提供了一种高密度培养固氮细菌，所示高密度培养固氮细菌是由上述的利用生物碳吸附性高密度培养固氮细菌的方法所制得。
本发明还提供了一种高密度培养的固氮细菌的应用，所培养的固氮细菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明把生物碳吸附性与液态发酵有机结合，提高了液体发酵的菌体密度，在不添加任何设备和不使用连续培养和半连续培养的条件下实现了固氮细菌的高密度培养；
(2)本发明所述的一种高密度培养固氮细菌的方法，不是单纯的利用生物碳作为吸附剂，它还利用生物碳固定二氧化碳的作用降低了发酵液中CO2的浓度，提高了培养基中的溶解氧浓度提高了菌体密度；
(3)本发明所述的一种高密度培养固氮细菌的方法，其制得的发酵液菌体浓度为1×1013～1×1015cfu/mL。所制得的发酵液可以经过离心、喷雾干燥，干燥的菌体粉活菌量高达1015～1017cfu/g。
附图说明
图1为本发明所述的一种高密度培养固氮细菌的方法的制备流程示意图。
具体实施方式
所述的菌体浓度的测定方法采用常规的微生物活菌计数法。
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
如图1所示，一种高密度培养固氮细菌的方法具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环褐球固氮菌斜面菌种到固氮细菌试管斜面培养基中，25℃培养10天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般营养琼脂培养基；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有20mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为10转/分，温度25℃的条件下，摇床培养86h，制成固氮细菌液体摇瓶菌种；所述液体摇瓶培养基是在在100℃条件下灭菌60min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖5g，蛋白胨1g，麸皮2g，牛肉浸膏1g，污泥生物碳3克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为0.2％的接种量接种，在温度为40℃，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下，培养18h，制成固氮细菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在124℃条件下灭菌44min制得，且每升种子罐培养基中含有蔗糖5g，蛋白胨1g，麸皮2g，牛肉浸膏1g，污泥生物碳3克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的固氮细菌种子罐菌种按体积比为0.2％接种量接入液体发酵培养基中，在温度40℃，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下，培养48小时，制得固氮细菌发酵液，该发酵液菌体浓度为5×1013cfu/mL；所述液体发酵培养基是在100℃条件下灭菌60min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖10g，蛋白胨1g，麸皮2g，酵母浸膏3g，植物油2g，污泥生物碳50克；
(5)将步骤(4)所制得的固氮细菌发酵液4500转/分钟离心15分钟，调节菌体浓度为1014cfu/mL，进风温度112℃，进样速度620mL/h，雾化压力0.09MPa，热风流量27M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1016cfu/g。
在本实施例中，所培养的固氮细菌是以污泥生物碳作为吸附剂，以褐球固氮菌作为出发菌株，经过上述方法所制得。
在本实施例中，所培养的固氮细菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例2
如图1所示，一种高密度培养固氮细菌的方法具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环内生固氮菌斜面菌种到固氮细菌试管斜面培养基中，40℃培养2天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般固氮细菌培养基；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有150mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为160转/分，温度40℃的条件下，摇床培养18h，制成固氮细菌液体摇瓶菌种；所述液体摇瓶培养基是在在130℃条件下灭菌10min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖20g，蛋白胨10g，麸皮20g，牛肉浸膏10g，动物粪便生物碳30克。
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为10％的接种量接种，在温度为25℃，搅拌转速为10转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下，培养96h，制成固氮细菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在103℃条件下灭菌60min制得，且每升种子罐培养基中含有蔗糖20g，蛋白胨10g，麸皮20g，牛肉浸膏10g，动物粪便生物碳27.8克。
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的固氮细菌种子罐菌种按体积比为10％接种量接入液体发酵培养基中，在温度25℃，搅拌转速为10转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下，培养96小时，制得固氮细菌发酵液，该发酵液菌体浓度为1×1015cfu/mL；所述液体发酵培养基是在130℃条件下灭菌10min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖50g，蛋白胨10g，麸皮20g，酵母浸膏20g，植物油8g，动物粪便生物碳5克。
(5)将步骤(4)所制得的固氮细菌发酵液4500转/分钟离心15分钟，调节菌体浓度为1014cfu/mL，进风温度112℃，进样速度620mL/h，雾化压力0.1MPa，热风流量30M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015cfu/g。
在本实施例中，所培养的固氮细菌是以动物粪便生物碳作为吸附剂，以内生固氮菌作为出发菌株，经过上述方法所制得。
在本实施例中，所培养的固氮细菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例3
如图1所示，一种高密度培养固氮细菌的方法具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一大豆根瘤菌斜面菌种到固氮细菌试管斜面培养基中，32℃培养6天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般固氮细菌培养基；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有80mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为85转/分，温度32℃的条件下，摇床培养52h，制成固氮细菌液体摇瓶菌种；所述液体摇瓶培养基是在在120℃条件下灭菌30min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖12g，蛋白胨6g，麸皮11g，牛肉浸膏6g，动物骨头生物碳16克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为5％的接种量接种，在温度为32℃，搅拌转速为70转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1:1的通气量条件下，培养56h，制成固氮细菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在118℃条件下灭菌30min制得，且每升种子罐培养基中含有蔗糖13g，蛋白胨6g，麸皮11g，牛肉浸膏6g，动物骨头生物碳18克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的固氮细菌种子罐菌种按体积比为5％接种量接入液体发酵培养基中，在温度为32℃，搅拌转速为70转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1:1的通气量条件下，培养72小时，制得固氮细菌发酵液，该发酵液菌体浓度为6×1014cfu/mL；所述液体发酵培养基是在120℃条件下灭菌30min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖30g，蛋白胨6g，麸皮11g，酵母浸膏12g，植物油5g，动物骨头生物碳26克；
(5)将步骤(4)所制得的固氮细菌发酵液8500转/分钟离心27分钟，调节菌体浓度为1016cfu/mL，进风温度118℃，进样速度750mL/h，雾化压力0.16MPa，热风流量37M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1017cfu/g。
在本实施例中，所培养的固氮细菌是以动物骨头生物碳作为吸附剂，以大豆根瘤菌作为出发菌株，经过上述方法所制得。
在本实施例中，所培养的固氮细菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例4
如图1所示，一种高密度培养固氮细菌的方法具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环花生根瘤菌斜面菌种到固氮细菌试管斜面培养基中，29℃培养8天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般固氮细菌培养基；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有130mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为140转/分，温度35℃的条件下，摇床培养25h，制成固氮细菌液体摇瓶菌种；所述液体摇瓶培养基是在在125℃条件下灭菌15min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖18g，蛋白胨8g，麸皮18g，牛肉浸膏9g，植物根茎生物碳28克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为0.2％的接种量接种，在温度为25℃，搅拌转速为10转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下，培养18h，制成固氮细菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在110℃条件下灭菌50min制得，且每升种子罐培养基中含有蔗糖18g，蛋白胨8g，麸皮18g，牛肉浸膏9g，，植物根茎生物碳13克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的固氮细菌种子罐菌种按体积比为0.2％的接种量接种，在温度为25℃，搅拌转速为10转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下，培养48小时，制得固氮细菌发酵液，该发酵液菌体浓度为6×1013cfu/mL；所述液体发酵培养基是在120℃条件下灭菌30min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖45g，蛋白胨8g，麸皮18g，酵母浸膏18g，植物油7g，植物根茎生物碳7克；
(5)将步骤(4)所制得的固氮细菌发酵液7000转/分钟离心30分钟，调节菌体浓度为1016cfu/mL，进风温度120℃，进样速度800mL/h，雾化压力0.08MPa，热风流量40M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015cfu/g。
在本实施例中，所培养的固氮细菌是以植物根茎生物碳作为吸附剂，以花生根瘤菌作为出发菌株，经过上述方法所制得。
在本实施例中，所培养的固氮细菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例5
如图1所示，一种高密度培养固氮细菌的方法具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环固氮菌斜面菌种到固氮细菌试管斜面培养基中，37℃培养4天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般固氮细菌培养基；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有35mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为25转/分，温度28℃的条件下，摇床培养24h，制成固氮细菌液体摇瓶菌种；所述液体摇瓶培养基是在在105℃条件下灭菌50min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖6g，蛋白胨2g，麸皮3g，牛肉浸膏2g，木屑生物碳5克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为10％的接种量接种，在温度为40℃，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下，培养96h，制成固氮细菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在105℃条件下灭菌50min制得，且每升种子罐培养基中含有蔗糖6g，蛋白胨2g，麸皮3g，牛肉浸膏2g，，木屑生物碳20克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的固氮细菌种子罐菌种按体积比为10％的接种量接种，在温度为40℃，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下，培养96h，制得固氮细菌发酵液，该发酵液菌体浓度为8×1014cfu/mL；所述液体发酵培养基是在120℃条件下灭菌30min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖12g，蛋白胨2g，麸皮3g，酵母浸膏4g，植物油2g，木屑生物碳49克；
(5)将步骤(4)所制得的固氮细菌发酵液6000转/分钟离心23分钟，调节菌体浓度为1016cfu/mL，进风温度120℃，进样速度600mL/h，雾化压力0.08MPa，热风流量36M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1017cfu/g。
在本实施例中，所培养的固氮细菌是以木屑生物碳作为吸附剂，以固氮菌作为出发菌株，经过上述方法所制得。
在本实施例中，所培养的固氮细菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例6
如图1所示，一种高密度培养固氮细菌的方法具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环花生根瘤菌斜面菌种到固氮细菌试管斜面培养基中，40℃培养4天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般固氮细菌培养基；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有110mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为100转/分，温度35℃的条件下，摇床培养29h，制成固氮细菌液体摇瓶菌种；所述液体摇瓶培养基是在在110℃条件下灭菌40min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖6g，蛋白胨2g，麸皮18g，牛肉浸膏10g，植物根茎生物碳19克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为8％的接种量接种，在温度为37℃，搅拌转速为80转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.4:1的通气量条件下，培养84h，制成固氮细菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在125℃条件下灭菌15min制得，且每升种子罐培养基中含有蔗糖6g，蛋白胨2g，麸皮18g，牛肉浸膏10g，植物根茎生物碳26克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的固氮细菌种子罐菌种按体积比为8％的接种量接种，在温度为37℃，搅拌转速为80转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.4:1的通气量条件下，培养84h，制得固氮细菌发酵液，该发酵液菌体浓度为3×1014cfu/mL；所述液体发酵培养基是在100℃条件下灭菌10min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖12g，蛋白胨2g，麸皮11g，酵母浸膏19g，植物油8g，植物根茎生物碳30克；
(5)将步骤(4)所制得的固氮细菌发酵液10000转/分钟离心10分钟，调节菌体浓度为1014cfu/mL，进风温度120℃，进样速度800mL/h，雾化压力0.2MPa，热风流量40M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015cfu/g。
在本实施例中，所培养的固氮细菌是以植物根茎生物碳作为吸附剂，以花生根瘤菌作为出发菌株，经过上述方法所制得。
在本实施例中，所培养的固氮细菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例7
如图1所示，一种高密度培养固氮细菌的方法具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环大豆根瘤菌斜面菌种到固氮细菌试管斜面培养基中，27℃培养9天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般固氮细菌培养基；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有100mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为120转/分，温度29℃的条件下，摇床培养58h，制成固氮细菌液体摇瓶菌种；所述液体摇瓶培养基是在在125℃条件下灭菌40min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖20g，蛋白胨10g，麸皮2g，牛肉浸膏1g，动物骨头生物碳28克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为3％的接种量接种，在温度为30℃，搅拌转速为25转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.5:1的通气量条件下，培养35h，制成固氮细菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在115℃条件下灭菌30min制得，且每升种子罐培养基中含有蔗糖20g，蛋白胨10g，麸皮2g，牛肉浸膏1g，动物骨头生物碳16克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的固氮细菌种子罐菌种3％的接种量接种，在温度为30℃，搅拌转速为25转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.5:1的通气量条件下，培养54h，制得固氮细菌发酵液，该发酵液菌体浓度为7×1013cfu/mL；所述液体发酵培养基是在130℃条件下灭菌60min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖50g，蛋白胨10g，麸皮13g，酵母浸膏3g，植物油2g，动物骨头生物碳26克；
(5)将步骤(4)所制得的固氮细菌发酵液4000转/分钟离心30分钟，调节菌体浓度为1016cfu/mL，进风温度110℃，进样速度600mL/h，雾化压力0.08MPa，热风流量20M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1017cfu/g。
在本实施例中，所培养的固氮细菌是以动物骨头生物碳作为吸附剂，以大豆根瘤菌作为出发菌株，经过上述方法所制得。
在本实施例中，所培养的固氮细菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例8
如图1所示，一种高密度培养固氮细菌的方法具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环内生固氮菌斜面菌种到固氮细菌试管斜面培养基中，34℃培养4天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般固氮细菌培养基；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有48mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为70转/分，温度31℃的条件下，摇床培养57h，制成固氮细菌液体摇瓶菌种；所述液体摇瓶培养基是在在108℃条件下灭菌50min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖13g，蛋白胨10g，麸皮20g，牛肉浸膏6g，污泥生物碳6克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为6％的接种量接种，在温度为36℃，搅拌转速为60转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.4:1的通气量条件下，培养72h，制成固氮细菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在130℃条件下灭菌10min制得，且每升种子罐培养基中含有蔗糖13g，蛋白胨10g，麸皮20g，牛肉浸膏6g，污泥生物碳30克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的固氮细菌种子罐菌种按体积比为6％的接种量接种，在温度为36℃，搅拌转速为60转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.4:1的通气量条件下，培养72小时，制得固氮细菌发酵液，该发酵液菌体浓度为2×1014cfu/mL；所述液体发酵培养基是在100℃条件下灭菌60min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖30g，蛋白胨10g，麸皮20g，酵母浸膏3g，植物油5g，污泥生物碳26克；
(5)将步骤(4)所制得的固氮细菌发酵液7000转/分钟离心20分钟，调节菌体浓度为1015cfu/mL，进风温度115℃，进样速度700mL/h，雾化压力0.13MPa，热风流量30M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1016cfu/g。
在本实施例中，所培养的固氮细菌是以污泥生物碳作为吸附剂，以环内生固氮菌作为出发菌株，经过上述方法所制得。
在本实施例中，所培养的固氮细菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例9
如图1所示，一种高密度培养固氮细菌的方法具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环褐球固氮菌斜面菌种到固氮细菌试管斜面培养基中，30℃培养9天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般固氮细菌培养基；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有90mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为60转/分，温度31℃的条件下，摇床培养27h，制成固氮细菌液体摇瓶菌种；所述液体摇瓶培养基是在在120℃条件下灭菌30min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖11g，蛋白胨1g，麸皮20g，牛肉浸膏6g，动物粪便生物碳18克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为6％的接种量接种，在温度为29℃，搅拌转速为22转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.3:1的通气量条件下，培养76h，制成固氮细菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在100℃条件下灭菌60min制得，且每升种子罐培养基中含有蔗糖11g，蛋白胨1g，麸皮20g，牛肉浸膏6g，动物粪便生物碳3克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的固氮细菌种子罐菌种按体积比为6％的接种量接种，在温度为34℃，搅拌转速为62转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.3:1的通气量条件下，培养80h，制得固氮细菌发酵液，该发酵液菌体浓度为9×1013cfu/mL；所述液体发酵培养基是在130℃条件下灭菌10min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖37g，蛋白胨10g，麸皮20g，酵母浸膏3g，植物油6g，动物粪便生物碳26克；
(5)将步骤(4)所制得的固氮细菌发酵液9000转/分钟离心13分钟，调节菌体浓度为1014cfu/mL，进风温度112℃，进样速度670mL/h，雾化压力0.12MPa，热风流量25M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015cfu/g。
在本实施例中，所培养的固氮细菌是以动物粪便生物碳作为吸附剂，以环褐球固氮菌作为出发菌株，经过上述方法所制得。
在本实施例中，所培养的固氮细菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。