本发明属于微生物领域，涉及类球红细菌制剂及其制备方法，具体涉及一种具有抗氧化活性的类球红细菌活菌及其菌剂的制备方法和用途。
背景技术：
光合细菌是自然界重要的一类微生物类群，因其含有丰富营养药用成分及独特生物转化功能而日益受到国内外学者广泛关注，其在保健食品领域中应用是普遍关注的焦点之一。当前国外，光合细菌已在保健食品中应用，可见光合细菌在保健食品中应用已有一定基础。
类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)属于紫色无硫光合细菌，是革兰氏阴性细菌，能够进行好氧、厌氧和黑暗中发酵等多种代谢途径，生存范围广，能产生超氧化物歧化酶(SOD)、辅酶Q10和类胡萝卜素等多种生物活性物质，已成为保健食品领域中一种非常有工业化开发潜力的微生物。
类胡萝卜素是(carotenoids)是自然界中广泛存在的一种天然色素。类胡萝卜素是维生素A原，具有清除自由基、抗氧化、增强免疫力、防癌等功能，作为着色剂和功能成分广泛应用于食品、医药和化妆品等，然而化学合成类胡萝卜素因毒性其应用受到限制。动物和人不能自身合成类胡萝卜素，只能从外界摄取才能满足身体需求。微生物生物合成商业化生物活性色素类胡萝卜素因其高效和易于操控受到广泛关注。
辅酶Q10作为有氧呼吸电子传递系统中的一种重要的电子载体，不仅是细胞呼吸和细胞代谢的激活剂，也是重要的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂，对清除体内自由基及稳定生物膜功能有重要作用。辅酶Q10可以用来治疗心血管疾病、癌症(尤其是乳腺癌)、牙周病，并且有助于预防药物的不良影响。辅酶Q10在神经系统疾病方面有很多应用，其中包括肌肉萎缩症、神经原性肌萎缩症和线粒体脑肌肉病变等。在最近几年，辅酶Q10也作为抗氧化剂应用于化妆品来延缓衰老。
超氧化物歧化酶(SOD)能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基，是生物体重要的细胞防御系统之一，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射和消炎作用，广泛应用于医药、保健食品和化妆品等领域。
目前已有文献报道了类球红细菌产类胡萝卜素、辅酶Q10、SOD这3种生物活性物质的发酵条件优化、提取纯化和鉴定。但是类胡萝卜素、辅酶Q10、SOD在提取中活性必然会收到损失，如何直接利用类球红细菌活菌同时获得这3种生物活性物质的研究不多，尤其是类球红细菌是否适于作为食品或保健食品供人食用还未见报道。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一株类球红细菌，该菌含有超氧化物歧化酶(SOD)、辅酶Q10和类胡萝卜素，具有强抗氧化活性，可作为保健食品使用。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述类球红细菌的活菌制剂。
本发明的又一个目的是提供上述类球红细菌的活菌制剂的制备方法。
本发明的还提供一个目的是上述类球红细菌的应用。
为了实现上述目的，本发明提供一株类球红细菌，菌种分类名称为：类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)WLC11，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2013年11月27日，保藏编号：CGMCC No.8513。
后述类球红细菌、类球红细菌8513、类球红细菌8513菌株均指本发明的菌株。
本发明还提供一种活菌菌剂，含有上述的类球红细菌的活菌，其含菌量为106cfu/mL-1010cfu/mL。
进一步地上述活菌菌剂为类球红细菌活菌的发酵液或活菌混悬液冻干粉剂。
本发明还提供上述活菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将上述述的类球红细菌菌株接种于平板固体培养基中培养37℃培养，3-5d，然后挑取单菌落接种到斜面固体培养基中37℃培养，3-5d；
2)挑取斜面培养基中单菌落接种于种子培养中进行32℃，180r/min摇床振荡培养24h得到一次种子液，然后取5％进行再次进行培养获得二次种子液；
3)按照10％的接种量将摇床活化的液体种子接种到液体发酵培养基中32℃，180r/min摇床振荡培养48h，得到发酵液；
或更进一步4)将发酵液8000r/min，4℃离心10min，用蒸馏水洗涤1次，a.将菌泥重悬于磷酸盐缓冲液中获得菌体混悬液，或b.采用冷冻干燥方法制成冻干粉剂。
优选地，所述固体培养基配方为：葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，氯化钠0.5％，琼脂2％，余量为水，pH8.5。
优选地，所述种子培养基配方为：葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，氯化钠0.5％，余量为水，pH7.2。
优选地，所述液体发酵培养基配方为：苹果酸0.4％，葡萄糖2％，胰蛋白胨0.7％，磷酸氢二钾0.09％，磷酸二氢钾0.06％，硫酸铵0.7％，生长因子溶液1％，余量为水，pH8.0。
其中生长因子溶液配方：维生素B1 0.1％，烟酰胺(VPP)0.1％，生物素0.0016％，对氨基苯甲酸0.1％，余量为水，pH8.0。
上述培养基除生长因子溶液经过滤灭菌外，均在121℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明还提供上述的类球红细菌或活菌菌剂作为保健食品的应用。
本发明的类球红细菌8513菌株是将类球红细菌3757菌株进行紫外线诱变育种而得到的突变菌株。类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)3757菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC NO.3757。
将类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)3757菌株紫外线诱变育种筛选类球红细菌3757菌株的主要步骤如下：在无菌操作条件下，将类球红细菌3757菌株的平板菌落采用稀释法，以85％NaCl溶液进行梯度稀释，稀释梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。随后暗室操作，将平板培养基置于紫外灯下照射，同批次分别用0s、30s，40s，50s进行诱变。随后放入不透光恒温培养箱中培养，培养温度为28℃，培养时间3-5d，以菌株长成为宜。当菌株长成后，根据菌株的生长情况进行筛选。同未处理的菌株作为对照，将长得比原始菌株较大的菌株挑出，标上号码，接种到固体平板培养基上，进行划线培养，培养温度28℃，培养时间3-5d，直到菌落长成；然后将长成的单菌落保存于4℃冰箱中，半年转接1次，获得初筛菌株。再将保藏的初筛菌株经过接种和液态发酵复筛出产类胡萝卜素产率较高的类球红细菌8513菌株，经测定其产率较原始菌株类球红细菌3757菌株提高了21.7％。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一株类球红细菌及其活菌制剂，该类球红细菌及其活菌制剂具有强抗氧化性，可通过制成保健食品供使用者一次性获得类胡萝卜素、辅酶Q10和SOD的抗氧化活性，实现抗衰老等目的，无需担心分别服用抗氧化物质的提取环节的有机溶剂污染问题，减少了生产环节，降低了生产成本。
具体实施方式
下面以具体实施例来说明本发明所要表达的核心思想。
实施例1制备类球红细菌活菌菌剂
1菌种活化
配置固体培养基(质量百分含量，以下同)：葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，氯化钠0.5％，琼脂2％，余量为水，pH8.5；并将其与培养皿置于121℃高压蒸汽灭菌20min；然后无菌条件下，倒平板，挑类球红细菌进行平板划线；将平板置于37℃培养，3-5d；
配置斜面培养基，斜面培养基与上述固体培养基一样，并于121℃高压蒸汽灭菌20min；无菌条件下，挑取上述平板上的类球红细菌单菌落进行斜面接种；然后将斜面置37℃培养，3-5d；
2类球红细菌发酵
2.1种子培养：
种子培养基：葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，氯化钠0.5％，余量为水，pH7.2；并于121℃高压蒸汽灭菌20min；
用无菌接种环从步骤(1)活化后的类球红细菌斜面中取菌体一环，接种到盛有250mL三角瓶中含有100mL种子培养基液体的三角瓶中，于32℃，180r/min摇床振荡培养24h，得到类球红细菌一次种子液；
然后无菌条件下，将得到的一次种子液按5％的接种量再接种于灭菌的种子培养基中，于32℃，180r/min摇床振荡培养24h，得到活化的类球红细菌二次种子液。
类球红细菌是光合细菌，但其可以在黑暗条件下进行好氧和厌氧发酵。
2.2发酵：
液体发酵培养基：苹果酸0.4％，葡萄糖2％，胰蛋白胨0.7％，磷酸氢二钾0.09％，磷酸二氢钾0.06％，硫酸铵0.7％，pH8，生长因子溶液1％，余量为水，其中生长因子溶液配方：维生素B1 0.1％，烟酰胺(VPP)0.1％，生物素0.0016％，对氨基苯甲酸0.1％；生长因子过滤除菌，其他培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min。
按照10％的接种量将摇床活化的液体种子接种到盛有液体发酵培养基的三角瓶中，于32℃，180r/min摇床振荡培养48h，得到类球红细菌发酵液；
3类球红细菌发酵液及活菌菌剂的制备
发酵液制备：发酵好的类球红细菌发酵液，调整发酵液活菌数分别109cfu/mL和108cfu/mL，4℃保存备用；
活菌混悬液制备：发酵好的菌液，8000r/min，4℃离心10min，用蒸馏水洗涤1次，将菌泥重悬于无菌磷酸盐缓冲液(KH2PO4 0.27g/L，Na2HPO4 1.42g/L，NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，pH 7.4)中，并调整活菌数分别为109cfu/mL和108cfu/mL。
调整活菌数可用MEM-EBSS(Minimum Essential Medium)基础培养基。
实施例2类球红细菌发酵液和活菌制剂体外抗氧化活性测定
对实施例1中得到的发酵液和活菌混悬液进行检测，检测指标包括：DPPH自由基清除率，还原性活力，羟自由基清除力，金属离子螯合力，抗脂质过氧化能力。采用Excel2003和SPSS12.0数据统计软件处理试验数据，每个试验重复3次。
1 DPPH自由基清除率
二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除法是抗氧化能力测定的重要指标，广泛用于抗氧化物质自由基清除能力的测定，其原理是基于抗氧化物质的供电子能力。DPPH自由基是一种具有稳定的未配对电子的化合物，样品对DPPH自由基的清除力主要说明了其给电子能力。DPPH自由基的乙醇溶液呈深紫色并在517nm处有吸收峰，自由基清除剂可与其单个电子配对，从而使颜色变浅，褪色程度与配对电子的数量有定量关系，所以可通过吸光值的降低表明样品对DPPH自由基的清除能力。
根据Shengyu Li[Shengyu Li，Yujuan Zhao，Li Zhang，et al.Antioxidant activity of Lactobacillus plantarum strains isolated from traditional Chinese fermented foods[J].Food Chemistry.2012，135:1914-1919.]描述的方法并加以改进来测定：
2mL类球红细菌，4mL 0.5mmol/L DPPH自由基乙醇溶液。将混合物剧烈混合均匀后在室温下避光孵育30min。对照组只有去离子水和DPPH溶液。空白组只包含乙醇和细菌。在10000r/min的条件下离心10min之后，所得溶液在517nm处平行测量三次。
DPPH清除能力定义为：
清除率(％)＝{1-(A样品–A空白)/A对照}×100％
发酵液和活菌混悬液均对DPPH自由基具有一定的清除效果，结果见表1。109cfu/mL的发酵液和活菌混悬液均具有较强的DPPH清除力，与108cfu/mL相比差异显著(P<0.05)，清除率分别为57.22％和54.91％，二者差异不显著(P>0.05)。对于类球红细菌菌体浓度为108cfu/mL时，发酵液有较高的DPPH清除率达到53.24％，而活菌混悬液为9.08％，二者相差较大且差异性显著(P<0.05)。
表1类球红细菌活菌菌剂的DPPH清除率
2还原性活力
物质的还原能力与其抗氧化活性之间有一定的相关性，铁氰化钾被抗氧化物质还原成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾与三价铁离子反应，生成的普鲁士蓝在700nm有最大吸收峰。吸光度越大，还原能力越强。
根据[Yichen Xia，Fatemeh Bamdad，Michaelet al.Fractionation and characterization of antioxidant peptides derived from barley glutelin by enzymatic hydrolysis[J].Food Chemistry，2012，134:1509–1518]描述的方法并加以改进来测定：
分别取109cfu/mL、108cfu/mL的类球红细菌活菌菌剂1mL，加入包含2.5mL的0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.6)和2.5mL 1％的铁氰化钾的混合溶液。将混合物在50℃下孵育20min然后，向反应混合物中加2.5mL 10％TCA(三氯乙酸)中止反应。在室温条件下，10000r/min离心10min，收集上清液。将2.5mL上清液中加入2.5mL去离子水稀释后，在加入0.5mL 1g/L FeCl3(氯化铁)反应10min。空白组用去离子水代替菌样品。用紫外分光光度计在700nm下测反应物的吸光值，反应混合物增加的吸光值显示了还原力的增强。
配置不同浓度抗坏血酸(Vc)溶液梯度(分别是0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL)代替样品做以上的步骤，测出吸光值，绘制抗坏血酸还原力的标准曲线，与样品的还原力进行比较。
由表2可以看出，109cfu/mL的发酵液和活菌混悬液均具有较强的还原力，二者差异显著(P<0.05)，还原力分别为202.15μg/mL和152.44μg/mL(相当于Vc含量)；菌体浓度明显影响类球红细菌样品的还原力，浓度为109cfu/mL样品的还原力明显大于108cfu/mL的样品。由同种浓度的菌体数量来看，发酵液的还原力明显高于活菌混悬液的还原力。
表2类球红细菌活菌菌剂的还原力
3羟自由基清除力
羟自由基清除实验运用Fenton反应。利用Fenton反应产生羟自由基，并加入亮绿显色剂，羟自由基使亮绿褪色。亮绿的吸光度发生变化，从而间接地测定羟自由基清除率。
根据[Rongmin Yu，Yin Yin，Wei Yang et al.Structural elucidation and biological activity of a novel polysaccharide by alkaline extraction from cultured Cordyceps militaris[J].Carbohydrate Polymers，2009，75:166–171.]描述的方法并加以改进来测定：
反应混合物包括1mL浓度为0.435mmol/L的亮绿，2mL浓度为0.5mmol/L的FeSO4(硫酸亚铁)，1.5mL的质量分数为3.0％的H202(过氧化氢)和1mL109cfu/mL、108cfu/mL的活菌菌剂。混合物在室温下反应20min后在624nm处测其吸光值，表示清除羟自由基的能力。
羟自由基清除率(％)＝(As-Ao)/(A-Ao)×100％
其中As是样品的吸光值；
Ao是对照组的吸光值，
A为无样品和Fenton反应的吸光值。
如表3所示，109cfu/mL的活菌混悬液具有最高的羟自由基清除率73.83％，且与其他3组相比具有显著性差异(P<0.05)。其他3组的羟自由基清除率较低，分别为109cfu/mL发酵液24.98％，108cfu/mL发酵液为34.03％，108cfu/mL活菌混悬液为29.95％。
二者活性差异分析是经发酵后的液体培养基中含有抑制羟自由基清楚的物质，导致其清除羟自由基能力不如活菌混悬液。
表3类球红细菌活菌菌剂的羟自由基清除力
4 Fe2+螯合能力
测定Fe2+螯合能力的大小是评价氧化剂抗氧化性能常用的方法之一，Fe2+螯合后可降低其在自由基氧化过程中催化作用，减少自由基生成。螯合能力越强被评价的抗氧化剂潜在的抗氧化性就愈强。Ferrozine(菲咯嗪)能够与Fe2+形成紫红色的螯合物，当其他有竞争力的螯合剂存在时，紫红色会变浅。通过螯合物颜色的变化，可以评价物质对Fe2+的螯合能力。
根据[Hong Zhuang,Ning Tang,Yuan Yuan，Purification and identification of antioxidant peptides from corn gluten meal[J].Journal of functional foods，2013，5:1810-1821.]描述的方法并加以改进来测定：
分别取2mL样品109cfu/mL、108cfu/mL的发酵液和活菌混悬液溶液与0.1mL的2mmol/L的氯化亚铁溶液混合均匀。3min后，混合物中加入0.2mL 5mmol/L ferrozine(菲咯嗪)激发反应，并加水至6mL。将混合物剧烈振动混匀后，在室温下反应10min在562nm处测反应混合物的吸光值。对于空白组，用3mL的去离子水代替样品，重复上面的操作。金属离子螯合能力计算如下：
Fe2+螯合力＝[(Ab–As)/Ab]×100％
其中Ab是空白组的吸光值
As是样品组的吸光值
如表4所示，109cfu/mL发酵液的Fe2+螯合能力为97.12％，108cfu/mL发酵液为94.41％，二者显著高于活菌混悬液的Fe2+螯合力(P<0.05)，109cfu/mL活菌混悬液为50.31％，108cfu/mL活菌混悬液为44.39％，且二者无显著性差异(P>0.05)。两种浓度发酵液的Fe2+螯合力显著高于活菌混悬液，很可能是类球红细菌发酵液中含有较多的金属离子螯合剂，从而增加其Fe2+螯合能力，进而增加其整体抗氧化能力。
表4类球红细菌活菌菌剂的Fe2+离子螯合力
5抑制脂质过氧化能力
硫氰酸铁盐(FTC)比色法是基于在酸性条件下，脂质氧化形成的过氧化物可将Fe2+氧化成Fe3+，然后Fe3+与硫氰酸根离子可形成在480-515nm内有最大吸收的红色络合物。通常用500nm处吸光值的高低表示物质抗脂质过氧化的能力，吸光值越小，表明物质的抗脂质过氧化能力越强。
根据[Hong Zhuang，Ning Tang，Yuan Yuan，Purification and identification of antioxidant peptides from corn gluten meal[J].Journal of functional foods，2013，5:1810-1821.]描述的方法并加以改进来测定：
分别取0.5mL类球红细菌浓度为109cfu/mL、108cfu/mL的发酵液和活菌混悬液溶解在5mL的50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，加入0.065mL的亚油酸和5mL的溶液中的99.5％的乙醇。用蒸馏水将总体积调节到12.5mL。将混合物在孵育40±1℃，在黑暗的环境反应7d。测定时，0.1mL反应混合物溶液用4.7mL的75％乙醇混合，再加入0.1mL 30％的硫氰酸铵，再加入0.1mL的20mmol/L氯化亚铁溶液的(用3.5％的HCl配制)。3min孵育后显色，表示亚油酸氧化程度。在500nm处每隔24h测一次，空白组用去离子水代替样品。
如表5所示，对于空白组，随着时间的推移脂质氧化程度逐渐增加。类球红细菌菌体浓度为109cfu/mL和108cfu/mL时，发酵液的抑制脂质过氧化能力均比活菌混悬液抑制能力强。在第4d之后，类球红细菌样品抑制脂质过氧化能力基本维持在同一水平。对于发酵液其浓度为109cfu/mL的抑制脂质过氧化能力更强，在第7d时，其抑制率菌体浓度为109cfu/mL的为80.22％，108cfu/mL的为70.36％；对于活菌混悬液来说其也有一定的抑制作用，在第7d时，109cfu/mL的抑制率为47.79％，108cfu/mL的抑制率为23.77％。综合来看，109cfu/mL浓度的发酵液具有最高的脂质过氧化抑制率，其具有最好的抗氧化活性，且与其他组差异性显著(P<0.05)。
表5类球红细菌活菌菌剂的抗脂质过氧化能力
实施例3类球红细菌活菌菌剂对Caco-2细胞抗氧化活性的影响
Caco-2细胞为人结肠癌细胞，购自北京协和细胞资源中心。
抗超氧阴离子测定试剂盒、抑制羟自由基能力试剂盒，LDH测定试剂盒(微孔板法)、总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒，过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。Caco-2细胞模型已经成为一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体外筛选工具。本发明的类球红细菌发酵液及活菌混悬液主要是为做肠道微生物保健品做准备，故选用Caco-2细胞作为细胞模型。
1 Caco-2细胞裂解液及上清液抗氧化活性测定
1.1试验分组
将生长良好的Caco-2细胞接种于6孔板，每孔保持3mL细胞培养液(含10％FBS(胎牛血清)、1％NEAA(非必须氨基酸)的MEM-EBSS完全培养基)，培养至细胞贴壁生长良好进行实验。按作用培养时间不同分为4组(12h，24h，36h，48h)，每组添加的H2O2(过氧化氢)浓度不同分为6个水平(0μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，150μmol/L，200μmol/L，250μmol/L)，每个水平3个重复。
1.2样品制备
不同作用培养时间时分别取出六孔板，将培养液吸取并装入10mL离心管，-80℃备用。每孔用配置的PBS(磷酸盐缓冲液)溶液迅速清洗3次，然后每孔加入0.5mL 1％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)进行裂解细胞，并用细胞刮刀使细胞脱离细胞板壁，并转移至1.5mL离心管中，冰浴30min。将细胞裂解混悬液进行离心(10000r/min，10min)，收集上清液得到细胞裂解液。
1.3指标测定
细胞裂解液：抗O2·-活力、抑制·OH能力；细胞上清：抗O2·-活力、抑制·OH能力、LDH活力(微孔板法)。均按照试剂盒说明书进行。
2不同H2O2浓度和时间对Caco-2细胞活性的影响
由表6可知随着时间的延长，细胞上清液中LDH(乳酸脱氢酶)活性升高，间接反映细胞的损伤增强。100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L和250μmol/L在各个时间与正常对照组相比显著升高(P<0.05)。在这4个浓度中，除100μmol/L的H2O2，其他各组培养上清LDH活性远远大于正常对照组，细胞损伤严重。50μmol/L除在24h和36h显著高于正常对照组(P<0.05)，其他时间显著性差异(P>0.05)。
表6不同条件下Caco-2细胞上清LDH活性
注：*同一时间，各浓度组与空白组差异显著(P<0.05)，**差异极显著(P<0.01)；#同一浓度，各时间组与12h差异显著(P<0.05)，##差异极显著(P<0.01)。下同。
设定正常对照组的存活率为100％。由表7可见，随着H2O2(过氧化氢)浓度升高，各处理组细胞相对存活率显著降低(P<0.05)。150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L的H2O2(过氧化氢)对细胞损伤较为严重，在各个时间点细胞相对成活率均在40％以下。50μmol/L H2O2(过氧化氢)处理的细胞相对成活率均在90％以上。100μmol/L的H2O2(过氧化氢)处理的细胞，12h时其成活率为79.27％，36h和48h时其相对成活率均在50％以下，而在24h时其相对成活率为63.57％。
表7不同条件下Caco-2细胞存活率
注：*同一时间，各浓度组与空白组差异显著(P<0.05)，**差异极显著(P<0.01)；#同一浓度，各时间组与12h差异显著(P<0.05)，##差异极显著(P<0.01)。下同。
3不同H2O2浓度和时间对细胞上清液抗氧化活性影响
对于细胞培养上清液的抗超氧阴离子能力，随着时间延长抗超氧阴离子能力成减弱趋势(表8)。与正常对照组相比，12h时各个浓度H2O2(过氧化氢)作用于Caco-2细胞培养上清液的抗超氧阴离子能力无显著性差异；添加50μmol/L H2O2(过氧化氢)时除在48h显著低于正常对照组(P<0.05)，在其他各个时间与其相比均无明显差异；添加100μmol/L H2O2(过氧化氢)时除在24h显著低于正常对照组(P<0.05)，在其他时间无明显差异；添加150μmol/L和200μmol/L浓度H2O2(过氧化氢)时除在12h与正常对照组相比无差异外，在其他时间均差异显著(P<0.05，P<0.01)。
如表8可知，随着时间延长抑制羟自由基能力整体来看呈减弱趋势，添加50μmol/L H2O2(过氧化氢)的Caco-2细胞除在12h时显著低于正常对照组(P<0.05)，在其他培养时间时均无显著差异；添加100μmol/L H2O2(过氧化氢)时，除在36h与正常对照组相比差异不明显，在其他时间均具有显著性差异(P<0.05)；添加150μmol/L和200μmol/L H2O2(过氧化氢)时在各个时间均显著低于正常对照组(P<0.05)。
表8不同条件下细胞培养上清抗超氧阴离子和抑制羟自由基能力
4不同H2O2浓度和时间对细胞裂解液抗氧化活性影响
细胞裂解液抗超氧阴离子能力随着时间的延长呈现出先增加后减弱的趋势(如表9)，表现为在细胞培养36h之前抗超氧阴离子能力逐渐增强，48h时又减弱。与正常对照组相比，Caco-2细胞添加50μmol/L H2O2(过氧化氢)后仅在48h时使其抗超氧阴离子能力显著降低(P<0.05)，其他时间无明显差异；添加100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L后Caco-2细胞在各个时间均显著低于正常对照组的抗超氧阴离子能力(P<0.05)。
随着时间的延续，Caco-2细胞裂解液的抑制羟自由基能力逐渐减弱(表10)。添加50μmol/L H2O2(过氧化氢)的细胞除在12h和24h明显低于正常对照组的抑制羟自由基能力(P<0.01)，在其他时间无显著性差异；添加100μmol/L、150μmol/L和200μmol/L H2O2(过氧化氢)的细胞的抑制羟自由基能力在各个时间均显著低于正常对照组(P<0.05)，且添加150μmol/L和200μmol/L H2O2(过氧化氢)的细胞其抑制能力远小于正常对照组。
表9不同条件下细胞裂解液抗超氧阴离子和抑制羟自由基能力
实施例4类球红细菌对氧化应激状态下Caco-2细胞抗氧化活性的影响
1 Caco-2细胞培养
Caco-2细胞培养于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，MEM-EBSS培养液中含10％胎牛血清，1％NEAA(非必需氨基酸)。1～2d换液，4～5d进行细胞传代。传代时以D-Hank’s平衡盐溶液洗涤，然后以0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化。
2试验分组
将生长状态较好的Caco-2细胞进行传代接种于6孔板，每孔保持2mL完全培养基。培养至细胞贴壁生长且生长状态良好时，36h左右。按照表10分为5组，每组3个重复。H2O2(过氧化氢)添加量最终浓度为100μmol/L，分别培养24h和36h。
3结果分析
将各试验组原培养液弃去，按照表10的添加方式进行实验。TBHQ(叔丁基对苯二酚)作为阳性对照抗氧化剂，其作用细胞的终浓度为2.75μg/mL，取实施例1制备的类球红细菌活菌混悬液，添加量分别为109cfu/mL和108cfu/mL，实验结果如表11所示。
表10试验分组
其中IV和V中R为类球红细菌活菌混悬液。
表11 24h和48h细胞培养上清抗氧化活性
注：结果以平均值±方差表示。*P<0.05，**P<0.01，分别表示同一时间与正常对照组对比差异显著和极显著；#P<0.05，##P<0.01分别表示同一时间与氧化应激组对比差异显著和极显著。
结果如表11所示，对于细胞培养上清液的LDH(乳酸脱氢酶)活性，在Caco-2细胞培养至24h时，加入抗氧剂TBHQ(叔丁基对苯二酚)和类球红细菌活菌混悬液的细胞处理组与正常对照组相比显著升高(P<0.05)，说明对细胞产生了一定的氧化损伤；与氧化应激组相比，除添加109cfu/mL浓度活菌混悬液的处理组与其无明显差异外，其他各组LDH活性均明显降低(P<0.05)。细胞培养48h时，除阳性对照组与正常对照组无明显差异，其他各组LDH(乳酸脱氢酶)活性均明显高于正常组(P<0.05)；与氧化应激组对比，除108cfu/mL活菌混悬液组与其无明显差异，其他各组细胞培养上清液的LDH(乳酸脱氢酶)活性显著增强(P<0.05)。总体来看，TBHQ(叔丁基对苯二酚)与类球红细菌活菌混悬液均减弱了H2O2(过氧化氢)对Caco-2细胞的氧化损伤，且TBHQ(叔丁基对苯二酚)的减弱程度高于类球红细菌活菌混悬液。
随着时间的推移细胞培养上清液的抗超氧阴离子能力和抑制羟自由基能力有所减弱，如表11所示。在Caco-2细胞培养至24h时，各处理组均与正常对照组和氧化应激组相比，细胞培养上清液的抗超氧阴离子能力明显增强(P<0.05)。细胞培养48h时，与氧化应激组相比，各处理组的细胞培养上清液的抗超氧阴离子的能力均明显高于氧化应激组(P<0.05)，且加活菌混悬液组的培养上清液的抗超氧阴离子能力高于阳性对照组。对于Caco-2细胞培养上清的抑制羟自由基的能力，细胞培养24h和48h时，各处理组均显著高于氧化应激组的抑制羟自由基能力(P<0.01)，且与正常对照组差异不显著；其中Ⅳ、Ⅴ这两组的抑制能力相差不大。
各个组细胞培养上清液的T-AOC(总抗氧化能力)在48h时相较于24h表现为有所提高，整体来看除氧化应激组，随着时间的推移各组的CAT(过氧化氢酶)活性均有所增加，如表11所示。阳性对照组在24h时其T-AOC和CAT活性显著高于氧化应激组(P<0.01，P<0.05)，但在48h时两种抗氧化指标与氧化应激组相比不存在显著性差异；加活菌混悬液组在24h和48h两个时间均明显高于氧化应激组的T-AOC和CAT活性(P<0.01，P<0.05)；其中109cfu/mL浓度活菌混悬液组的T-AOC和CAT活性高于添加108cfu/mL浓度活菌混悬液组，即菌体浓度高的处理组其细胞培养上清液的总抗氧化能力和过氧化氢酶酶活性高于菌体浓度低组。
整体来看，向Caco-2细胞培养液中加入抗氧化剂TBHQ和类球红细菌活菌混悬液后，降低了H2O2对细胞的氧化损伤，并在一定程度上提高了Caco-2细胞培养上清的抗氧化活性，且整体抗氧化活性大小为：添加菌体浓度为109cfu/mL的活菌混悬液组>阳性对照组>添加菌体浓度为108cfu/mL活菌混悬液组。
4类球红细菌对细胞裂解液抗氧化活性的影响
同样方法检测细胞裂解液抗氧化活性，结果如表12所示。
表12 24h和48h细胞裂解液抗氧化活性
如表12所示随着时间的推移Caco-2细胞裂解液的谷胱甘肽过氧化物酶活性(GSH-PX)、抗超氧阴离子能力和超氧化物歧化酶(SOD)酶活性有所增强。细胞培养24h时，阳性对照组、Ⅳ组这2组的GSH-PX酶活性明显高于氧化应激组(P<0.01)；48h时，各个处理组组的GSH-PX酶活性均显著高于氧化应激组，酶活性大小顺序为：添加活菌混悬液为109cfu/mL组>阳性对照组>添加活菌混悬液为108cfu/mL组。
对于细胞裂解液抗超氧阴离子活力和超氧化物歧化酶(SOD)活性，如表12所示：阳性对照组和添加活菌混悬液109cfu/mL组在细胞培养24h和48h时其细胞裂解液的这2种抗氧化指标均显著高于氧化应激组(P<0.05)。对于抗超氧阴离子能力，添加活菌混悬液为108cfu/mL组仅在48h时显著高于氧化应激组。对于SOD活性，添加109cfu/mL活菌混悬液组仅在细胞培养48h时其细胞裂解液的的抗超氧阴离子能力显著高于氧化应激组(P<0.01)；添加108cfu/mL活菌混悬液组在24h和48h时其细胞裂解液均未表现出显著性差异与氧化应激组相比。
整体来看，类球红细菌菌株活菌混悬液当其作用Caco-2细胞的浓度为109cfu/mL时和抗氧化剂TBHQ均可以更好地提高氧化应激状态下的Caco-2细胞的抗氧化活性，且前者比后者的效果更好。
从上述实施例可以看出：(1)通过对类球红细菌菌株8513活菌菌剂体外抗氧化能力的测定，结果显示类球红细菌8513具有较强的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、还原力、Fe2+金属离子螯合力和抗脂质过氧化能力，且整体表现抗氧化活性与菌体浓度呈量效关系，即对于大多数的抗氧化指标，高浓度菌体的类球红细菌活菌菌剂具有较强的抗氧化能力。对于相同菌体浓度的类球红细菌样品组，其整体抗氧化能力表现为发酵液>活菌混悬液；其原因很可能是发酵液中含有增强抗氧化能力的物质。
(2)首先建立起了Caco-2细胞氧化应激模型，H202浓度为100μmol/L，作用时间为24h。通过检测细胞培养上清液和细胞裂解液的各项抗氧化指标来检测类球红细菌对Caco-2细胞抗氧化活性的影响。总的来说，对于Caco-2细胞的细胞培养上清：向Caco-2细胞培养液中加入抗氧化剂TBHQ和类球红细菌8513活菌菌剂后，降低了H2O2对细胞的氧化损伤，并在一定程度上提高了Caco-2细胞培养上清的抗氧化活性，且整体抗氧化活性大小为：添加菌体浓度为109cfu/mL活菌混悬液组>阳性对照组>添加菌体浓度为108cfu/mL活菌混悬液组。对于Caco-2细胞裂解液：类球红细菌8513活菌混悬液当其作用Caco-2细胞的浓度为109cfu/mL时和抗氧化剂TBHQ均可以更好地提高氧化应激状态下的Caco-2细胞的抗氧化活性，且前者比后者的效果更好。综合实验结果表明，类球红细菌8513活菌混悬液可以增强Caco-2细胞氧化应激状态下的抗氧化活性，且活菌混悬液对Caco-2细胞抗氧化活性的影响效果与菌体浓度呈量效关系，即菌体浓度越高则抗氧化活性越强，表现为109cfu/mL活菌混悬液组的抗氧化活性大于108cfu/mL活菌混悬液组的抗氧化活性。
上述发酵液和活菌混悬液均属活菌菌剂的液体剂型，我们也可以经过冷冻干燥制备保持菌体活性的类球红细菌冻干粉剂。可直接作为保健食品服用或作为复合保健食品的组分发挥其中类胡萝卜素、辅酶Q10和SOD的抗氧化活性。现有分别服用不同来源的类胡萝卜素、辅酶Q10和SOD的保健方式，在不同原料中分离其中的抗氧化活性物质需要经过繁琐的提取过程，并且在提取过程中添加多种有机溶剂，不仅会影响这些物质的活性，并且纯化时难以完全去除掉添加的有机溶剂，这些有机溶剂多数都会对机体产生不良影响。本发明通过服用类球红细菌的活菌菌剂不仅可同时摄入类胡萝卜素、辅酶Q10和SOD，能同时发挥这三种生物活性物质的抗氧化活性，及其协同作用，并且无需再分别提取各个物质，无有机溶剂污染问题，抗氧化物质活性保存好，生产制备方便快捷，生产成本低。