一种增强真菌染色液及配制方法和应用与流程

本发明属于医学检验领域，具体涉及一种增强真菌染色液及其配制方法和应用。

背景技术：

真菌(Fungus)是一种真核生物。最常见的真菌是各类蕈类，另外真菌也包括霉菌和酵母。现在已经发现了七万多种真菌，估计只是所有存在的一小半。大多真菌原先被分为动物或植物。

目前，真菌在分类学上已独立为界，与动物界、植物界、原核生物界和原生生物界平行。真菌具有坚固的细胞壁和真正的细胞核，不含叶绿素，是异养性的，以寄生或腐生方式生存，典型者兼有有性生殖和无性生殖，产生各种形态的孢子。根据生长特性与形态差异，可将真菌简单分为酵母、真菌和蕈(蘑菇)。其中对人类有致病性的真菌约有300多个种类。除新型隐球菌和蕈外，医学上有意义的致病性真菌几乎都是霉菌。根据侵犯人体部位的不同，临床上将致病真菌分为浅部真菌和深部真菌。真菌性肠炎即属于深部真菌病。浅部真菌(癣菌)仅侵犯皮肤、毛发和指(趾)甲，而深部真菌能侵犯人体皮肤、黏膜、深部组织和内脏，甚至引起全身播散性感染。深部真菌感染肠道即表现为真菌性肠炎，可独立存在如婴儿念珠菌肠炎，或为全身性真菌感染的表现之一，如艾滋病并发播散性组织胞浆菌病。

徐红、顾菊林(医学真菌检验.中国真菌学杂志，2006,1(2)：111-116)采用直接镜检进行真菌检验，所用复方氢氧化钾溶液配方包括氢氧化钾、二甲基亚砜(DMSO)、甘油，配方加入DMSO促进角质溶解，有甘油涂片不易干，不易制成氢氧化钾结晶，但采用该配方制作产品，仍存在组织背景与真菌显色对比不明显，阳性检出率低等的问题。

另外，尽管有些荧光染色液的报道，但是存在的问题仍然很多，如染色效果欠佳、需要将不同的组份分开配置和储存，形成不同包装的试剂配合使用，否则染色液会有结晶和分层现象，生产成本高，使用步骤繁琐、被检样本无法长期保存留档，组织切片染色过程中容易脱片等。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种增强真菌染色液，各成分可稳定共存于同一体系中，通过荧光染色快速检测真菌的染色液，染色液稳定性及染色效果好。本发明的第二个目的是提供该增强真菌染色液的配制方法。本发明的第三个目的是提供该增强真菌染色液在真菌形态学中的应用，在临床致病菌的检测和诊断中具有重要作用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种增强真菌染色液，以重量百分比计，包括：

本发明增强真菌染色液为一个溶液体系，以水为溶剂，其他所有的成分均分散于水中，可稳定共存于同一体系中，在生产、销售、使用过程中，不需要将多种成分分开配置、储存，使得运输和使用都更加方便。

本发明组份中：

氢氧化钾能够溶解皮屑、甲屑标本中的角质细胞及其他杂质，更好的呈现真菌形态。氢氧化钾浓度过低，检出效果差，过高会造成氢氧化钾结晶析出。优选的，所述的氢氧化钾的质量分数为5-15％，所述水的质量分数为61.45-80％。

二甲基亚砜能够加速溶解皮屑、甲屑标本中的角质细胞及其他杂质，防止荧光素和氢氧化钾的结晶析出，浓度过低时不能够起到防止氢氧化钾结晶的效果，浓度过高则增强液会出现分层现象。优选的，所述的二甲基亚砜的质量分数为15-20％，进一步为16-19％，，所述水的质量分数为61.45-80％。

甘油使待检样本不易干，便于涂片长期保存，甘油浓度过高也会导致增强液会出现分层现象。优选的，所述甘油的质量分数为2-5％。

伊文思蓝能够弱化背景颜色，使组织背景与待检菌体显色对比明显，提高观察效果。优选的，所述依文思蓝的质量分数为0.3-0.5％。

优选的，所述的荧光增白剂的质量分数为0.02-0.04％。

增强真菌染色液通过特殊荧光素与真菌细胞壁结合，并吸收紫外光(波长340-380nm)，使菌丝及孢子发出明亮的蓝色荧光，在荧光显微镜下真菌轮廓和黑暗背景可形成明显反差，易于在镜下寻找及识别，其真菌的形态结构更为清晰。本发明采用上述特定种类、一定百分比范围的组份能够保证染色液的均一稳定，在保证稳定性的同时具有优异的染色效果。

优选的，以重量百分比计，所述的增强真菌染色液包括：

进一步优选的，以重量百分比计，所述的增强真菌染色液包括：

所述的荧光增白剂为荧光素-28。

所述的水可采用去离子水。

本发明还提供了所述的增强真菌染色液的配制方法，包括：

(1)使荧光增白剂、氢氧化钾、二甲基亚砜和甘油分散于部分水中，得A液；

(2)将伊文思蓝溶于剩余的水中，得B液；

(3)搅拌条件下，将B液滴加到A液中，得所述的增强真菌染色液。

步骤(1)中，其中一种可实施的A液的配制方法包括：

将荧光增白剂分散于一部分水中，得甲液；

将氢氧化钾溶于余下的水中，冷却后，加入甘油和二甲基亚砜溶解，冷却得乙液；

搅拌条件(转速可以为80-100转/分)下，将乙液滴加至甲液中，得所述的A液。

氢氧化钾溶于水中会产生热量，所以需要将其冷却(一般需不高于20℃)后再加入甘油和二甲基亚砜，可在搅拌状态加入甘油和二甲基亚砜以利于溶解，溶解过程中还会产生热量，需要将其冷却(一般需不高于40℃)后才能进行下一步，防止破坏荧光素。

步骤(1)中，另一种可实施的A液的配制方法包括：

将荧光增白剂分散于一部分水中，得甲液；

将甘油和二甲基亚砜溶于一部分水中，冷却得丁液；

将氢氧化钾溶于余下的水中，冷却后，得氢氧化钾溶液；

将丁液滴加到甲液中溶解后，再滴加氢氧化钾溶液，得所述的A液。

步骤(3)中，搅拌的转速可以为80-100转/分。将B液滴加到A液中，可以防止荧光素和伊文思蓝的析出。

本领域人员可以理解，在溶液配制过程中，涉及的“一部分水”指的是本领域人员根据目标成分的溶解度，选择适宜体积的水达到能够溶解目标成分的目的即可，只要保证配方总水量(即各成分最终浓度)，分步骤中的水量可灵活选择。

本发明还提供了所述的增强真菌染色液在真菌鉴别中的应用。

真菌鉴别可以为疾病诊断中的应用，也可以为非疾病诊断中的应用。

真菌可以为皮肤癣菌、马拉色菌、念珠菌、曲霉及各类变异的菌丝结构。

本发明增强真菌染色液适用的标本包括皮屑、甲屑、毛发、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水、妇科分泌物等。

与现有技术相比，本发明的增强真菌染色液具有如下有益效果：

(1)本发明增强真菌染色液为一个溶液体系，以水为溶剂，其他所有的成分均分散于水中，可稳定共存于同一体系中，以往的荧光染色液由于试剂本身的原因需要将不同的组份分开配置和储存，形成不同包装的试剂配合使用，这样不仅增加了生产成本，同时使用时也比较麻烦，而本发明增强真菌染色液在一个包装中，运输生产成本降低，使用时直接吸取染色液一步染色处理即可，非常方便。

本发明还提供了所述增强真菌染色液的配制方法，简单，可避免某些成分析出。

(2)本发明配制的增强真菌染色液是一款新型的快速真菌感染检测产品，可用于检测新鲜或冰冻临床样本，石蜡及乙二醇甲基丙烯酸酯包埋的组织、痰液、尿液、妇科分泌物及其他体液中可能存在的各类真菌。增强真菌染色液中的荧光物质将与各类组织中可能存在的真菌细胞壁结合，从而可以在荧光显微镜下观察到真菌的具体形态。

(3)本发明配制的增强真菌染色液通用性强，能够与各类真菌(霉菌及酵母)的细胞壁结合从而产生荧光标记，包含皮肤癣菌、马拉色菌、念珠菌、曲霉及各类变异的菌丝结构。适用于皮屑、甲屑、毛发、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水、妇科分泌物等各种标本。

(4)增强真菌染色液染色可通过反复染色使因放置时间过长而使荧光减少的样本恢复荧光，也可通过重复染色步骤大幅减少背景荧光，使菌丝与孢子更为明显。并且增强真菌染色液染色对于标本中菌丝、孢子由于荧光的标记使得寻找相对容易，也便于识别，真菌菌丝、孢子清晰显现，检测灵敏度大幅提高。增强真菌染色液特异性高，能使少量真菌着染，弥补了传统的KOH湿片法在真菌数量少时检出率不高的不足，并且染色时间短，结果直观，能快速有效的找到标本中的菌丝或孢子，并且结构清晰，明显地提高了标本的阳性率。

(5)本发明配置的增强真菌染色液对脂肪滴不产生标记，与传统KOH湿片法对孢子和脂肪滴无法分辨相比，易于鉴别。

附图说明

图1为实施例2本产品100×荧光染色图；

图2为实施例2本产品染色结果图；

图3为实施例2传统革兰氏染色结果图。

具体实施方式

以下对本发明原理和特征进行举实例描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明实施例的试剂原料来源如表1所示。

表1

实施例1

1、配方组成如表2所示。

表2

2、增强真菌染色液配制方法如下：

(1)甲液：使用精密分析天平称取配方量的荧光增白剂28，加去离子水溶解。

(2)乙液：称取配方量氢氧化钾加去离子水溶解，20℃慢慢在搅拌中加入甘油和配方比例重量的二甲基亚砜，至完全溶解。待液体冷却至40℃以下。

(3)丙液：称取配方量伊文思蓝，加去离子水溶解。

(4)甲液在不断的搅拌中(80-100转/分)，滴加乙液，滴加完毕。

(5)甲乙混合液不断搅拌中(80-100转/分)，滴加丙液，滴加完毕，持续搅拌5分钟。称重，并补充挥发水份至配方量。密封容器口。

室温避光静置24小时，分装。

配制时，申请人还曾尝试以下配制方法：

方法1：在去离子水中一次性统一加入各原料进行搅拌，发现溶解困难，且荧光素和伊文思蓝有析出。

方法2：(1)甲液：使用精密分析天平称取配方量的荧光增白剂28，加去离子水溶解。

(2)乙液：称取配方量氢氧化钾加去离子水溶解，20℃慢慢在搅拌中加入甘油和配方比例重量的二甲基亚砜，至完全溶解。待液体冷却至40℃以下。

(3)丙液：称取配方量伊文思蓝，加去离子水溶解。

(4)乙液在不断的搅拌中(80-100转/分)，滴加甲液，滴加完毕，发现存在荧光素析出现象。

方法3：

(1)甲液：使用精密分析天平称取配方量的荧光增白剂28，加去离子水溶解。

(2)乙液：称取配方量氢氧化钾加去离子水溶解，20℃慢慢在搅拌中加入甘油和配方比例重量的二甲基亚砜，至完全溶解。待液体冷却至40℃以下。

(3)丙液：称取配方量伊文思蓝，加去离子水溶解。

(4)甲液在不断的搅拌中(80-100转/分)，滴加乙液，滴加完毕。

(5)丙液不断搅拌中(80-100转/分)，滴加甲乙混合液，滴加完毕，持续搅拌5分钟，发现伊文思蓝存在析出现象。

3、增强真菌染色液的使用方法

(1)显微镜选择：荧光显微镜滤波器的选择根据使用的显微镜型号不同而有所改变。紫外光，卡尔科弗卢尔荧光增白剂白色激发滤镜(Ultra Violet，Calcofluor White Filter)340nm至380nm，配有430nm压制滤镜。如果在染色过程中有复染步骤，则荧光材料的颜色需为蓝色，并且需要红色的背景。H3紫蓝光，宽频异硫氰酸荧光激发滤镜(H3Violet Plus Blue，Wide Band FITC Filter)420nm至490nm，配有515nm压制滤镜。如果在染色过程中有复染步骤，则荧光材料的颜色需为绿色，并且需要红色的背景。

(2)将载物片放置在水平位置上，直接向样本上滴几滴增强真菌染色液。增强液以覆盖或淹没整个样品为准，使其中成分与多聚物进行充分的结合反应，持续染色两分钟。

(3)盖上盖玻片，吸去多余染液，置于荧光显微镜下观察即可。

(4)荧光显微镜下观察。

实施例2 600例临床标本检测阳性率对比

对600例患者的标本分别采用本发明实施例1的配方和背景技术中所述配方以及革兰氏染色进行真菌检测，结果如下表所示：

表3

利用本产品和传统革兰氏染色法对真菌感染样本进行染色，本产品染色结果(图2)背景色差大，区分明显，真菌与荧光素结合完全发出荧光，极易分辨。传统革兰氏染色(图3)背景不易区分，且无法分辨真菌形态，很容易被忽略。从而验证了本产品的优越性和有效性。另外，与KOH湿片法相比，本发明染色液大大提高了阳性检出率。

实施例3增强真菌染色液稳定性测试

对以下浓度范围的荧光染色液进行稳定性测试。

表4

1、热稳定性测试：

将待检增强液样品置于80℃水浴一周，取出，肉眼观察液体没有分层；滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察，无结晶析出；用接种环取少许红色毛癣菌置于载玻片，滴一滴增强液，1分钟后，盖上盖玻片，轻压后用吸水纸吸取多余液体，置荧光显微镜下观察，菌丝发蓝色荧光，内部结构清晰，背景无杂质，荧光衰减周期大于10分钟。

与常温下放置的增强液样品对比无明显差异。

2、冷稳定性测试：

将待增强液样品置于-20℃，反复冻融7次，取出，肉眼观察液体没有分层；滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察，无结晶析出；用接种环取少许红色毛癣菌置于载玻片，滴一滴增强液，1分钟后，盖上盖玻片，轻压后用吸水纸吸取多余液体，置荧光显微镜下观察，菌丝发蓝色荧光，内部结构清晰，背景无杂质，荧光衰减周期大于10分钟。

将待检荧光染色液样品于-20℃冰箱放置一年，取出，肉眼观察液体没有分层；滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察，无结晶析出；用接种环取少许红色毛癣菌置于载玻片，滴一滴增强液，1分钟后，盖上盖玻片，轻压后用吸水纸吸取多余液体，置荧光显微镜下观察，菌丝发蓝色荧光，内部结构清晰，背景无杂质，荧光衰减周期大于10分钟。

3、常温稳定性测试：

将待检样品荧光染色液置于室温2年，肉眼观察液体没有分层；滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察，无结晶析出；用接种环取少许红色毛癣菌置于载玻片，滴一滴增强液，1分钟后，盖上盖玻片，轻压后用吸水纸吸取多余液体，置荧光显微镜下观察，菌丝发蓝色荧光，内部结构清晰，背景无杂质，荧光衰减周期大于10分钟。

实施例4

1、二甲基亚砜

采用单因素实验，改变二甲基亚砜的浓度，考察二甲基亚砜对染色液效果的影响。染色的样本为红色毛癣菌。

表5

结果如下：

实施例5

荧光增白剂28

采用单因素实验，改变荧光增白剂28的浓度，考察荧光增白剂28对染色液效果的影响。染色的样本为红色毛癣菌。

表6

结果如下：

实施例6

氢氧化钾

采用单因素实验，改变氢氧化钾的浓度，考察氢氧化钾对染色液效果的影响。检测样本为阳性皮屑样本。

表7

结果如下：

实施例7

甘油

采用单因素实验，改变甘油的浓度，考察甘油对染色液效果的影响。染色的样本为红色毛癣菌。

表8

结果如下：

随甘油浓度升高，显微镜视野会存在轻微的分层现象(10％)，但是对比不明显，对染色效果影响不明显。

实施例8

伊文思蓝

采用单因素实验，改变伊文思蓝的浓度，考察伊文思蓝对染色液效果的影响。染色的样本为红色毛癣菌。

表9

结果如下：