一种基于绿针假单胞菌的脂肽的合成方法与流程

本发明涉及一种基于绿针假单胞菌的脂肽的合成方法。

背景技术：

脂肽(Lipopeptide，LP)是假单胞菌和杆菌等微生物合成的生物表面活性剂，可影响细胞生长、运动、生物膜合成等功能，对多种植物和人类病原体如病毒、支原体、锥虫、细菌、真菌和卵菌具有广谱的拮抗作用，拥有重要的医药开发潜力。其中，由玫瑰孢链霉菌合成的达托霉素(Daptomycin)是第一种商业化的脂肽类抗生素，对革兰氏阳性病原菌包括一些耐药菌具有良好的抗菌作用，可抑制葡萄球菌、肠球菌的生长和繁殖，其疗效与安全性均较好。

脂肽的结构具有显著的多样性，除氨基酸个数、种类和成环的位置不同外，其脂肪酸链的长度也有差异，一些还带有羟基。根据这些差异可将脂肽分为多种类型，每个类型中因其氨基酸组成的细微差异又分为数个亚型。脂肽中少量为线性脂肽，多数可形成内酯环，称为环脂肽(Cyclic lipopeptide，简称CLP)，其分子由脂肪酸连接多肽环构成。研究发现，脂肽合成蛋白一般由多个模块组成，每个模块负责合成脂肽分子中的一个氨基酸，且其序列具有较高的同源性。基于这种规律，可研究脂肽合成蛋白中不同模块对应的基序(motif)，通过聚类分析预测脂肽的氨基酸种类。研究表明，脂肽对假单胞菌和杆菌生物膜的形成具有重要影响，但不同类型脂肽的作用效果相差很大；另外，生物表面活性剂可改变物体表面的黏度，影响细胞分裂和运动。在植物相关环境下，微生物合成的表面活性剂可作为叶片表面疏水角质层的润滑剂，不仅可以促进细胞运动，还有利于物质的溶解和扩散。

绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66是上海交通交通大学从水稻根际分离的生防菌株，其主要代谢产物为吩嗪-1-甲酰胺(Phenazine-1-carboxamide，PCN)，即一种高效和广谱的抗真菌剂。此外，该菌株可合成铁载体Pyoverdine(Pvd)和Achromobactin(Acr)、杀虫蛋白FitD(P.fluorescens insecticidal toxin)和氢氰酸(HCN)等产物，具有良好的生物防治潜力。经生物信息学分析，该菌株基因组中存在一个完整的脂肽合成基因簇(clpABC)，但该脂肽物质的种类和功能并不清楚。文献调研发现，虽然目前有许多微生物合成脂肽的报道，但至今未见绿针假单胞菌中脂肽化合物的研究；在数株绿针假单胞菌的基因组学研究中，也仅发现菌株HT66具有脂肽合成基因簇。因此，在绿针假单胞菌中进行脂肽物质的鉴定、合成与功能的研究，不仅有助于了解菌株HT66的生物防治机制，还可以拓展人们对绿针假单胞菌中脂肽结构和功能的认识。

尽管目前上海交通大学已经公开了一种生防绿针假单胞菌HT66中脂肽的鉴定与功能(熊欣等)，但是该技术方案仅仅是公开了生防绿针假单胞菌HT66可以用于肽脂的合成，但是后续如何获得更高产量的肽脂、如何在最短时间内获得肽脂等实际应用问题，该文献并未明确给出，所以其仅仅是提供了一种定性描述，为了实际应用，急需开拓一种具体的基于生防绿针假单胞菌的肽脂合成方法。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于生防绿针假单胞菌的脂肽的合成方法，特别是一种合成成本低、合成周期短、脂肽产量高的基于生防绿针假单胞菌的脂肽的合成方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种基于绿针假单胞菌的脂肽的合成方法，具体包括：对绿针假单胞菌进行发酵培养，即获得含有肽脂的发酵液。

优选地，所述发酵培养的条件为：25～30℃、200～300r/min、25～50mL/250mL装样量。

进一步优选地，所述发酵培养的条件为下述(1)、(2)、(3)中的一种或者几种的组合：

(1)25℃、200r/min、25～50mL/250mL装样量；或，

(2)28℃、250r/min、25～50mL/250mL装样量；或，

(3)30℃、300r/min、25～50mL/250mL装样量。

特别优选地，所述发酵培养的条件为：在25～50mL/250mL装样量下，25℃、200r/min发酵48～60h，28℃、250r/min发酵36～48h，30℃、300r/min发酵24～36h。

优选地，所述发酵培养的培养基为KB培养基。

进一步优选地，所述KB培养基的组分配比为：每1L的KB培养基中含蛋白胨20g，甘油15mL，磷酸氢二钾0.514g，硫酸镁0.732g，余量为水，pH 7.5。

优选地，所述合成方法，还包括将发酵培养所得发酵液进行抽提获得肽脂粗提物、并对所述粗提物溶解后进行色谱分离的步骤。

优选地，所述抽提采用的抽提液为氯仿-甲醇(2：1)溶液。

优选地，所述粗提物溶解采用的溶剂为乙腈溶解。

优选地，所述色谱分离参数设定具体如下：色谱柱为Waters CORTECS 1.6μm(2.1mm×100mm)，柱温为45℃，进样量为1μL，流速为0.4mL/min，检测波长为254nm和210nm；梯度洗脱条件为：0min，水95％，乙腈5％；1.5min，水80％，乙腈20％；3.5min，水60％，乙腈40％；5min，水40％，乙腈60％；7min，水15％，乙腈85％；8-11min，乙腈100％；11.5-13min，水95％，乙腈5％。

本发明为了确保上述技术方案，还涉及了结果验证相关内容，具体涉及用于分析所述合成方法合成了肽脂的绿针假单胞菌突变菌株，所述突变菌株是在绿针假单胞菌野生菌株的基础上，采用同源重组的无痕敲除方法对脂肽合成基因簇clp序列进行突变株构建的；其中，所述同源重组中，扩增所述脂肽合成基因簇clp上游同源臂的引物对如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，上游同源臂的引物对如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本研究首次通过生物信息学手段预测了绿针假单胞菌HT66中脂肽的氨基酸组成及顺序,构建了脂肽合成基因缺失突变株HT66Δclp，根据突变株缺失代谢产物的UPLC/QTOF-MS信息验证预测结果，并研究了脂肽对该菌株的生长、吩嗪-1-甲酰胺合成、生物膜形成和群集运动性的影响。通过比对野生型和突变株代谢产物的质谱信息确定该产物为黏液菌素；脂肽合成基因缺失后，菌株HT66的生长无明显变化，但其PCN合成、生物膜形成和群集运动性均有不同程度的下降。菌株HT66的脂肽产物为黏液菌素，对菌株的代谢、生物膜形成和运动型等生物学功能具有重要的调控作用。本专利首次报道了绿针假单胞菌中一种脂肽分子的结构与功能，为研究其合成和调控机制及开发和应用奠定了基础。不仅有助于了解假单胞菌中脂肽的合成与调控，而且为其开发和应用奠定了基础。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为不同脂肽中氨基酸模块的聚类分析；

图2为菌株HT66Δclp的PCR验证图谱；

图3为脂肽的UPLC/Q-TOF验证；

其中，A1、A2，分别为菌株HT66和HT66Δclp的脂肽粗提物在254nm下的UPLC图；B1、B2，分别为菌株HT66和HT66Δclp的脂肽粗提物在210nm下的UPLC图；C1、C2，分别为HT66和HT66Δclp的脂肽粗提物的基峰离子色谱图(BPI)；D，菌株HT66中脂肽产物的质谱图；E，Viscosin的结构式；

图4为脂肽对菌株HT66生长(A)和PCN合成(B)的影响；

图5为脂肽对菌株HT66生物膜形成的影响；

图6为脂肽对菌株HT66群集运动性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1：脂肽合成蛋白的聚类分析

选取绿针假单胞菌HT66中脂肽合成蛋白序列和其他假单胞菌中已知结构的脂肽合成蛋白序列，进行模块分析，构建系统发育树；根据待预测模块序列的同源性和所处位置确定对应的氨基酸及其排列顺序。蛋白序列的确定参照文献(Gross H,Stockwell VO,Henkels MD,et al.The genomisotopic approach:a systematic method to isolate products of orphan biosynthetic gene clusters[J].Chemistry&Biology,2007,14(1):53-63)。

蛋白序列分析发现，菌株HT66的脂肽合成蛋白含有9个模块，表明合成的脂肽产物由9个氨基酸组成。从NCBI数据库中发明人找到了4株能合成脂肽且其分子结构已鉴定的假单胞菌(见表1)，共收集脂肽合成基因簇中的39个模块序列及其对应的氨基酸种类，与菌株HT66的脂肽合成基因簇一起建库，构建系统发育树(见图1)，分析各个模块中的保守序列。

由图1可知，脂肽分子中相同氨基酸呈现了较好的聚类关系，因此推测菌株HT66所产脂肽的氨基酸序列应为L-Leu-D-Glu-D-allo-Thr-D-Val-L-Leu-D-Ser-L-Leu-D-Ser-L-Ile，与文献报道的脂肽化合物Viscosin的氨基酸种类及顺序一致。

实施例2：脂肽合成基因簇缺失株构建

依据菌株HT66全基因组序列进行引物设计。扩增脂肽合成基因簇clp上游同源臂的引物对(5’-3’)为：

clp-F1(SEQ ID NO.1)：CGGAATTCAGCATCTTCGCCGCAAACAG(EcoRI)，

clp-R1(SEQ ID NO.2)：CCGGGATGAATGGGTAGTCG；

扩增clp下游同源臂的引物对为：

clp-F2(SEQ ID NO.3)：ACTACCCATTCATCCCGGCGGGCTATGGATGGGTTCG，

clp-R2(SEQ ID NO.4)：CGGATCCTGGAGATCGCCGCGTCTTC(BamHI)。

PCR体系和程序参照文献进行(Gross H,Stockwell VO,Henkels MD,et al.The genomisotopic approach:a systematic method to isolate products of orphan biosynthetic gene clusters[J].Chemistry&Biology,2007,14(1):53-63)。基因组DNA提取、质粒抽提、电泳凝胶片段回收、酶切、产物纯化和连接等均按试剂盒说明书进行操作。采用同源重组的无痕敲除方法对相关序列进行突变株构建，相关方法参照文献(Du X,Li Y,Zhou W,et al.Phenazine-1-carboxylic acid production in a chromosomally non-scar triple-deleted mutant Pseudomonas aeruginosa using statistical experimental designs to optimize yield[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(17):7767-78)。以菌株HT66基因组为模板，使用clp-F1和clp-R1、clp-F2和clp-R2分别扩增脂肽合成基因簇上、下游同源臂。将产物纯化，作为模板，用引物clp-F1和clp-R2扩增获得融合片段。将融合片段和质粒pK18mobsacB酶切并连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，进行蓝白斑筛选和PCR验证，测序正确后，获得重组质粒pK18-clp。抽提质粒，转化大肠杆菌S17感受态，在Kan、Amp双抗培养基中与菌株HT66共培养，获得接合转移的单交换菌株。将菌液稀释，涂布于含10％蔗糖的LB平板上，分别在LB和含Kan的LB平板中进行影印筛选，仅能在LB平板中生长的为双交换菌株。最后，使用clp-F1和clp-R2进行筛选，可扩增出与融合片段一致的条带者为菌株HT66的脂肽合成基因缺失突变株HT66Δclp。

为进一步鉴定菌株HT66脂肽产物的结构，构建了菌株HT66的脂肽合成基因缺失突变株HT66Δclp。在突变株中，可用clp-F1和clp-R2扩增出长约1kb的clp上下游同源臂融合片段，而在野生株基因组中该对引物间的序列长达33kb，无法使用PCR扩增出特异性片段，这表明突变株构建成功(图2)。

实施例3：脂肽产物的质谱分析

将菌株HT66和HT66Δclp分别在KB培养基中发酵，取24h发酵液使用氯仿-甲醇(2:1)溶液抽提脂肽产物，取有机相并用氮气吹干(Smyth T,Rudden M,Tsaousi K,et al.Protocols for the isolation and analysis of lipopeptides and bioemulsifiers[M].New York；Humana Press.2014:1-26)。粗提物以乙腈溶解，过滤后用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪(UPLC/QTOF-MS)检测。仪器为Waters ACQUITYTM UPLC&Q-TOF MS Premier。色谱柱为Waters CORTECS 1.6μm(2.1mm×100mm)，柱温为45℃，进样量为1μL，流速为0.4mL/min，检测波长为254nm和210nm；梯度洗脱条件为：0min，水95％，乙腈5％；1.5min，水80％，乙腈20％；3.5min，水60％，乙腈40％；5min，水40％，乙腈60％；7min，水15％，乙腈85％；8-11min，乙腈100％；11.5-13min，水95％，乙腈5％。选用正离子化模式，分子量范围为50-2 000。

由图3可知，当使用芳香环化合物的特征波长254nm进行检测时，菌株HT66和HT66Δclp的脂肽分析谱图未发现明显差异(图3中A1、A2)，说明该脂肽化合物不含芳香族氨基酸。当使用210nm波长进行检测时，野生型在约7.7min处有一吸收峰(图3中B1)，而菌株HT66Δclp的分析谱图中无该峰(图3中B2)，推断该物质为脂肽。此外，从基峰离子色谱图(BPI)则可明显发现，野生型在7.7min处存在一个较高的离子峰(图中3中C1)，而菌株HT66Δclp则没有该峰(图3中C2)，说明其很可能是脂肽离子化后形成的离子峰。

提取该峰的质谱图(图3中D)发现，该物质最大丰度的质荷比([M+H]⁺)为1 126.7137，而根据数据库预测，该产物的最大丰度质荷比([M+H]⁺)应为1 126.70(100％)，其次为1 127.70(64.0％)和1 128.71(19.0％)，与文献报道Viscosin的质谱信息相符合(De Bruijn I,De Kock MJ,Yang M,et al.Genome-based discovery,structure prediction and functional analysis of cyclic lipopeptide antibiotics in Pseudomonas species[J].Molecular Microbiology,2007,63(2):417-28)(图3中E)，表明菌株HT66合成的脂肽物质应为Viscosin。

实施例4：脂肽对细胞生长及PCN合成的影响

菌株活化后，接种至KB培养基中，初始OD₆₀₀值为0.02，培养并取样，方法具体为：在28℃、180r/min振荡培养。使用分光光度计检测OD₆₀₀值；样品制备后，使用高效液相色谱(HPLC)测定PCN产量。HPLC使用的色谱柱为WondaSil-WR C-18反相柱(5μm×250mm)。样品制备方法和PCN的HPLC检测条件参照文献(Tan J,Xiong X,Liang W,et al.Breeding of a phenazine-1-carboxamid-producing strain by ARTP mutation and its optimization of fermentation[J].Biotechnology Bulletin,2016,32(1):174-9.(in Chinese))。

将菌株HT66和HT66Δclp在相同条件下培养，分别测定其生长曲线(见图4A)和PCN产量(见图4B)。可见，脂肽合成基因缺失后，菌株HT66的生长没有明显差异，但稳定期菌体量更高。此外，脂肽缺失后，PCN合成量显著减少，在48h时约减少22.7％。

实施例5：脂肽对细胞生物膜形成的影响

菌株活化后，在24孔板中静置培养48h，吸去菌液后，以结晶紫对生物膜进行染色，然后以乙醇脱色并用酶标仪检测脱色液的OD600值。具体方法参照文献(Selin C,Fernando WD,De Kievit T.The PhzI/PhzR quorum-sensing system is required for pyrrolnitrin and phenazine production,and exhibits cross-regulation with RpoS in Pseudomonas chlororaphis PA23[J].Microbiology,2012,158(4):896-907)。

为考察脂肽对菌株HT66生物膜形成的影响，以新鲜培养基作为对照，测定菌株HT66和HT66Δclp的生物膜形成能力，结果如图5所示。相比野生型，敲除脂肽合成基因簇后，菌株HT66生物膜形成量大幅减少，约为野生型的49.3％。

实施例6：脂肽对细胞运动性的影响

在运动性检测平板上进行菌株的群集运动实验。相关操作参照文献(Wei X,Huang X,Tang L,et al.Global control of GacA in secondary metabolism,primary metabolism,secretion systems,and motility in the rhizobacterium Pseudomonas aeruginosa M18[J].Journal of Bacteriology,2013,195(15):3387-400)。

在运动性平板上检测菌株HT6和HT66Δclp的群集运动情况，结果如图6所示。可见二者菌苔形态类似，均呈现分枝状，并带有晕圈，但脂肽缺失后，运动半径减小，表明菌株HT66群集运动能力明显下降。

在上述实施例的基础上，本发明还提供一种高效、快捷的基于绿针假单胞菌的脂肽的合成方法，具体如下实施例所示：

实施例7-10

下述实施例提供一种基于绿针假单胞菌的脂肽的合成方法，具体包括：将绿针假单胞菌接种于KB培养基；于三角瓶中发酵培养，具体参数如下：

表2

经过大量实验证明：

1、本发明在下述条件下均可实现：所述酵培养的条件为：25～30℃、200～300r/min、25～50mL/250mL装样量。如果超出了本发明的限制，将会使得菌体生长受到影响、代谢受到抑制。

2、本发明含有优选方案：所述发酵培养的条件为下述(1)、(2)、(3)中的一种或者几种的组合：(1)25℃、200r/min、25～50mL/250mL装样量；或，(2)28℃、250r/min、25～50mL/250mL装样量；或，(3)30℃、300r/min、25～50mL/250mL装样量。在该优选方案条件下，肽脂的产量比对照明显上升。

3、本发明还有特别优选的方案，即所述发酵培养的条件为：在25～50mL/250mL装样量下，30℃、300r/min发酵12h；28℃、250r/min发酵12h，25℃、200r/min发酵12h。在此条件下，不仅可以实现肽脂产量的提升，而且还有助于肽脂的合成期提前，缩短培养时间，降低合成成本。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。