一种微载体的再生方法及其应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微载体的再生方法及其应用。

背景技术：

微载体直径通常在60～400μm，一般由天然葡聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、交联纤维素或者各种合成的聚合物制成，适用于贴壁型的动物细胞生长，通常与多种生物反应器联合使用。微载体主要具有如下优点：单位体积的细胞产率高(载体比表面积大)、占用空间小、易观察、易控制、稳定、在反应器中易放大、劳动强度小等。

目前GE公司的Cytopore系列微载体、Nunc公司的Biosilon微载体和Anawa公司的Mica微载体等广泛应用于生物制药领域，是一种化学稳定细胞培养基质。这种微载体制造技术要求高，国内虽有单位进行仿制研究，但是效果较差，所以只能依赖于国外进口，但进口的微载体由于技术的垄断，其价格昂贵，显著增加了企业的经营难度。为了降低成本，许多企业对微载体的重复利用进行了研究，但目前尚没有实用高效的微载体再生方法。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种微载体的再生方法。

本发明提供的方法包括如下步骤：用酶或酶液消化使用过的微载体，以实现微载体再生；

所述酶为胰蛋白酶或胶原酶；

所述酶液为胰蛋白酶溶液或胶原酶溶液。

上述方法中，所述用酶或酶液消化使用过的微载体为将所述使用过的微载体、PBS溶液和所述酶液混匀，反应，收集沉淀即得到消化后的微载体；

所述使用过的微载体、所述PBS溶液与所述酶液的配比为1kg:(1-3)L:(1-6)L；

所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的质量分数为0.001-0.5％；

所述胶原酶溶液中胶原酶的质量分数为0.001-0.3％。

上述方法中，

所述使用过的微载体、所述PBS溶液与所述酶液的配比具体为0.8kg:0.8L:1.6L或5kg:15L:15L或5kg:10L:20L；

所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的质量分数为0.125％；

所述胶原酶溶液中胶原酶的质量分数为0.005％。

上述方法中，在所述消化前还包括预漂洗的步骤：所述预漂洗为将所述使用过的微载体与所述PBS溶液混匀，搅拌，收集沉淀即得到预漂洗后的微载体；

在所述消化后还包括漂洗的步骤：所述漂洗为将所述消化后的微载体与所述PBS溶液混匀，搅拌，收集沉淀即得到再生后的微载体；

所述漂洗后还包括灭菌的步骤。

上述方法中，所述预漂洗的步骤中，所述使用过的微载体与所述PBS溶液的体积比为1:(1-5)；

所述漂洗的步骤中，所述消化后的微载体与所述PBS溶液的体积比为1:(1-10)。

上述方法中，所述预漂洗和所述漂洗的步骤均重复2-3次。

上述方法中，所述反应的条件为15～38℃反应0.5-24h。

上述方法中，所述使用过的微载体为培养过贴壁细胞的微载体，所述微载体为微载体(Cytodex 1)或微载体(Cytodex 3)；所述贴壁细胞为Vero细胞。

本发明的另一个目的是提供上述方法制备得到的微载体。

本发明还有一个目的是提供上述微载体的新用途。

本发明提供了上述微载体在贴壁细胞培养中的应用。

本发明最后一个目的是提供一种培养贴壁细胞的方法。

本发明提供的培养贴壁细胞的方法包括如下步骤：将贴壁细胞与上述微载体混匀，培养，得到培养后的贴壁细胞。

上述方法中，所述贴壁细胞为Vero细胞。

本发明提供了一种简便、实用、高效的微载体再生方法。该方法是将微载体用胰蛋白酶溶液或胶原酶溶液消化后，再用等渗PBS溶液冲洗，即可实现微载体的高效再生。与现有技术相比，本发明没有使用酸、碱等可能引起微载体结构破坏的试剂，且再生的微载体培养效果与新微载体基本一致，再生率可达到95％以上。

附图说明

图1为本发明中新微载体(Cytodex 1)的显微照片。

图2为本发明中新微载体用于贴壁细胞培养的显微照片。

图3为本发明中实施例1再生后的微载体的显微照片。

图4为本发明中实施例1再生后微载体用于贴壁细胞培养的显微照片。

图5为本发明中实施例2再生后的微载体的显微照片。

图6为本发明中实施例2再生后微载体用于贴壁细胞培养的显微照片。

图7为本发明中实施例3再生后的微载体的显微照片。

图8为本发明中实施例3再生后微载体用于贴壁细胞培养的显微照片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的微载体(Cytodex 1)是美国GE公司的产品，产品目录号(货号)为17-0448-04。

下述实施例中的微载体(Cytodex 3)是美国GE公司的产品，产品目录号(货号)为17-0485-02。

下述实施例中的PBS溶液的制备方法：取磷酸二氢钠1.217g，磷酸氢二钠4.37g，氯化钠8.19g，用水稀释至1000ml。

下述实施例中的质量分数为0.125％的胰蛋白酶溶液的制备方法：氯化钠8g，氯化钾0.4g，磷酸二氢钾0.06g，磷酸氢二钠0.152g，EDTA 0.125g，胰蛋白酶1.25g，用1000ml水溶解。其中，胰蛋白酶是美国Gibco公司的产品，货号为27250-018。

下述实施例中的质量分数为0.005％的胶原酶溶液的制备方法：氯化钠8g，氯化钾0.4g，磷酸二氢钾0.06g，磷酸氢二钠0.152g，EDTA 0.125g，胶原酶0.05g，用1000ml水溶解，即得胶原酶溶液。其中，胶原酶是美国Gibco公司的产品，货号为17100-017。

下述实施例中的199培养基是Gibco公司的产品，货号03-5008EJ。

下述实施例中的Vero细胞购于American type culture collection(ATCC)，编号CCL-81。

实施例1、微载体的再生方法及其效果

一、微载体的再生方法

1、预漂洗

将使用过的刚下罐的0.8kg微载体(Cytodex 3)加入5L烧杯中，加入1.6L的PBS溶液，磁力搅拌10分钟，待微载体沉降后，弃上清，收集沉淀；重复上述步骤2次，得到预漂洗后的微载体。

2、酶消化

将0.8kg步骤1得到的预漂洗后的微载体、0.8L PBS溶液和1.6L质量分数为0.005％的胶原酶溶液混匀，37℃反应3小时，反应期间不断搅拌；待载体沉降后，弃上清，收集沉淀即得到消化后的微载体。

3、漂洗

向步骤2中得到的消化后的微载体中加入3L的PBS溶液，搅拌10分钟，待微载体沉降后，弃上清，收集微载体；重复上述步骤2次，得到0.79kg漂洗后的微载体。回收率为回收后微载体质量/回收前的微载体质量，计算回收率为0.79kg/0.8kg*100％＝99％。

4、灭菌

将步骤3得到的漂洗后的微载体，进行121℃高压湿热灭菌，灭菌60分钟，得到再生后的微载体(图3)。

5、保存

将步骤4得到的再生后的微载体于2～8℃，密闭保存，备用。

二、微载体再生后的效果

分别用新微载体(Cytodex 1)(图1)和步骤一中得到的再生后的微载体对贴壁细胞(Vero细胞)进行培养。具体步骤如下：将Vero细胞、500ml培养液(199培养基)和17ml微载体混匀，37℃，搅拌速度50rpm，培养5天。

结果如图2和图4所示，从图中可以看出，贴壁细胞在新微载体和步骤一中得到的再生后的微载体上的生长状况均良好，均基本没有游离细胞，细胞生长形态无显著性差异。说明本发明中再生后的微载体可以用于贴壁细胞培养。

实施例2、微载体的再生方法及其效果

一、微载体的再生方法

1、预漂洗

将使用过的刚下罐的5kg微载体(Cytodex 1)加入42L不锈钢罐中，加入25L的PBS溶液，搅拌10分钟，待微载体沉降后，弃上清，收集沉淀；重复上述步骤3次，得到预漂洗后的微载体。

2、酶消化

将5kg步骤1得到的预漂洗后的微载体、15L PBS溶液和15L质量分数为0.125％的胰蛋白酶溶液混匀，37℃反应1小时，反应期间不断搅拌，反应结束后，弃上清，收集沉淀即得到消化后的微载体。

3、漂洗

向步骤2中得到的消化后的微载体中加入30L的PBS溶液，搅拌10分钟，待微载体沉降后，弃上清，收集微载体；重复上述步骤3次，得到4.85kg漂洗后的微载体。回收率为回收后微载体质量/回收前的微载体质量，计算回收率为4.85kg/5.0kg*100％＝97％。

4、灭菌

将步骤3得到的漂洗后的微载体，进行121℃高压湿热灭菌，灭菌60分钟，得到再生后的微载体(图5)。

5、保存

将步骤4得到的再生后的微载体于2～8℃，密闭保存，备用。

二、微载体再生后的效果

分别用新微载体(Cytodex 1)(图1)和步骤一中得到的再生后的微载体对贴壁细胞(Vero细胞)进行培养。具体步骤如下：将Vero细胞、500ml培养液(199培养基)和17ml微载体混匀，37℃，搅拌速度50rpm，培养5天。

结果如图2和图6所示，从图中可以看出，贴壁细胞在新微载体和步骤一中得到的再生后的微载体上的生长状况均良好，均基本没有游离细胞，细胞生长形态无显著性差异。说明本发明中再生后的微载体可以用于贴壁细胞培养。

实施例3、微载体的再生方法及其效果

一、微载体的再生方法

1、预漂洗

将使用过的刚下罐的5kg微载体(Cytodex 1)加入42L不锈钢罐中，加入25L的PBS溶液，搅拌10分钟，待微载体沉降后，弃上清，收集沉淀；重复上述步骤3次，得到预漂洗后的微载体。

2、酶消化

将5kg步骤1得到的预漂洗后的微载体、10L PBS溶液和20L质量分数为0.125％的胰蛋白酶溶液混匀，37℃反应3小时，反应期间不断搅拌，反应结束后，弃上清，收集沉淀即得到消化后的微载体。

3、漂洗

向步骤2中得到的消化后的微载体中加入30L的PBS溶液，搅拌10分钟，待微载体沉降后，弃上清，收集微载体；重复上述步骤2次，得到4.8kg漂洗后的微载体。回收率为回收后微载体质量/回收前的微载体质量，计算回收率为4.8kg/5kg*100％＝96％。

4、灭菌

将步骤3得到的漂洗后的微载体，进行121℃高压湿热灭菌，灭菌60分钟，得到再生后的微载体(图7)。

5、保存

将步骤4得到的再生后的微载体于2～8℃，密闭保存，备用。

二、微载体再生后的效果

分别用新微载体(Cytodex 1)(图1)和步骤一中得到的再生后的微载体对贴壁细胞(Vero细胞)进行培养。具体步骤如下：将Vero细胞、500ml培养液(199培养基)和17ml微载体混匀，37℃，搅拌速度50rpm，培养5天。

结果如图2和图8所示，从图中可以看出，贴壁细胞在新微载体和步骤一中得到的再生后的微载体上的生长状况均良好，均基本没有游离细胞，细胞生长形态无显著性差异。说明本发明中再生后的微载体可以用于贴壁细胞培养。