本发明属于生物技术领域，具体涉及一种内皮祖细胞氧化应激模型的构建方法。
背景技术：
内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一类具有游走特性的能定向增殖分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，主要起源于骨髓，在成人的外周血中少量存在，其对于缺血组织的血管新生和损伤血管的再内皮化起着重要作用。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子活性自由基(FR)产生过多，氧化系统和抗氧化系统失衡，大量FR不断聚积，从而导致组织损伤，引发各种疾病。氧化应激的标志物包括活性氧自由基(ROS)如:阴离子(O2－)、羟自由基(OH)和过氧化氢(H2O2)等和活性氮自由基(RNS)，如:一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)和过氧化亚硝酸盐(ONOO－)等。虽然，对氧化应激的高抵抗力是干细胞的特征性表现，内皮祖细胞线粒体基质中抗氧化酶MnGSH-PX和GPx-1高表达，具有一定的抗氧化应激能力。但在长期氧化应激存在的情况下，氧化应激通过减弱其抗氧化酶的表达，增加氧化酶的表达，促进内皮祖细胞的凋亡和老化而影响其功能及数量，抑制内皮祖细胞的增殖和迁移，影响其动员。
氧化低密度脂蛋白是低密度脂蛋白氧化修饰后的产物，氧化低密度脂蛋白具有很强的细胞毒性，可选择性作用于细胞循环周期的S期，对增殖活跃期细胞的细胞毒作用更强。氧化低密度脂蛋白可以阻止VEGF诱导的内皮祖细胞分化，促进其老化，导致细胞功能失调。
现有技术经常用高糖作用于内皮祖细胞，研究糖尿病等高糖处理模型相关疾病。目前还未见关于内皮祖细胞氧化应激模型建立方法的研究报道。氧化低密度脂蛋白处理内皮细胞建立氧化应激模型，对于研究动脉粥样硬化、高血压、冠心病等心血管疾病和相应的抗氧化物质以及机理有广阔的应用空间。
技术实现要素：
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本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种内皮祖细胞氧化应激模型的构建方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述内皮祖细胞氧化应激模型建立的方法包括如下步骤：
(1)将购买的人外周血单个核细胞接种在人纤连蛋白涂层(FN)的多孔培养板中培养，每孔加入1mL M199培养液，于37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养；
(2)培养2—4d，优选3d后洗去未贴壁细胞，添加M199培养液继续培养，以后每隔2—4d，优选3d换M199培养液；
(3)用胰酶消化经步骤(2)培养的细胞制成细胞悬液，取细胞悬液并加入与细胞悬液等体积的氧化低密度脂蛋白，得混合液，氧化低密度脂蛋白在混合液中的终浓度为50至200μg/mL，优选为100μg/mL；再于37℃5％CO2饱和湿度的培养箱中培养20—30h，优选24h；
(4)用胰酶消化经步骤(3)培养的细胞，离心后用PBS洗涤，然后用MTT法测定细胞生长抑制率，用细胞样用流式细胞仪测定细胞凋亡情况，并测定代表细胞氧化应激情况的参数，构建成内皮祖细胞氧化应激模型；优选的离心条件为在1000g离心5min。
其中，所述M199培养液中含有胎牛血清、VEGF、bFGF、青霉素及链霉素；所述胎牛血清的重量百分比含量为10％，VEGF的浓度为10ng/mL，bFGF的浓度为10ng/mL，青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为100U/mL。
步骤(3)氧化低密度脂蛋白的制备方法如下：将低密度脂蛋白在EDTA的0.01mol/L PBS中4℃透析24h，去除EDTA，然后在终浓度含80μmol/LCuCl2的PBS中37℃氧化24h，冷却至4℃终止氧化，即得氧化低密度脂蛋白。
步骤(4)所述代表细胞氧化应激情况的参数包括活性氧、GSH-Px和线粒体膜电位。
与现有技术相比，本发明内皮祖细胞氧化应激模型首次为内皮祖细胞的研究构建了模型，且所用的氧化低密度脂蛋白对于内皮祖细胞的损伤也鲜见报导，本发明所述的培养条件和方法，能够帮助内皮祖细胞氧化应激的研究人员，比较顺利的完成内皮祖细胞氧化应激模型的构建。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1：
所述内皮祖细胞氧化应激模型的构建方法包括如下步骤：
1、将购买的人外周血单个核细胞接种在人纤连蛋白涂层(FN)的培养皿中培养，每孔加入1mL包含有10％胎牛血清、VEGF(10ng/mL)、bFGF(10ng/mL)、青霉素(100U/mL)及链霉素(100U/mL)的M199培养基，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养。
2、3天后洗去未贴壁细胞，添加培养液继续培养，以后每隔3天换培养液。
3、制备氧化低密度脂蛋白:新购置的低密度脂蛋白在EDTA的0.01mol/L PBS中4℃透析24h，去除EDTA，然后在终浓度含80μmol/LCuCl2的PBS中37℃氧化24h，冷却至4℃终止氧化，鉴定氧化低密度脂蛋白氧化程度后再使用。
4、用胰酶消化细胞制成细胞悬液，取适量的红细胞悬液，加入与悬液等体积的氧化低密度脂蛋白，其终浓度分别为0、50、100、150、200μg/mL，37℃5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h。
5、将培养后的内皮祖细胞用胰酶消化，在1000g离心3分钟，PBS洗两次后，细胞样用MTT法测定其生长抑制率，用流式细胞仪测定凋亡情况，并测定活性氧，GSH-Px和线粒体膜电位等代表其氧化应激情况的参数。(结果见表1).
表1不同浓度氧化低密度脂蛋白产生活性氧、GSH-Px的量和线粒体膜电位及细胞生长抑制率和凋亡比例
通过以上结果可以看出，氧化低密度脂蛋白可以诱导内皮祖细胞的氧化应激，且随着浓度的增大内皮祖细胞的氧化损伤效果也越明显，因此，可以以氧化低密度脂蛋白诱导构建内皮祖细胞的氧化应激模型。在具体应用此模型来评估具抗氧化能力的活性物质的功效时，可将药物组与损伤组、正常组作比较，通过各个组氧化应激参数的比较来衡量，此时，100μmol/ml损伤效果明显但不过于严重，为较适宜的浓度。
实施例2：应用氧化低密度脂蛋白诱导构建的内皮祖细胞的氧化应激模型进行具有抗氧化能力的活性物质的筛选
经实施例1损伤方法处理内皮祖细胞，选取1—3号样品进行试验，待细胞单层铺满80％，用无血清M199培养基配置成不同浓度的样品溶液，每孔加入不同浓度的药液至800μL，使每孔终浓度与实验设计相符，每组设3个复孔。分别按实施例1中方法，检测氧化应激相关参数。(结果见表2)
表2不同样品处理内皮祖细胞后产生活性氧、GSH-Px的量和线粒体膜电位及细胞生长抑制率和凋亡比例
与对照组比较，模型组(药物浓度100μmol/ml)氧化损伤严重，细胞损伤最大。与模型组比较，53个候选样品，均能降低凋亡比例、细胞生长抑制率，并减少活性氧的产生，升高线粒体膜电位，增加GSH-Px的量。据此可认为3种活性物质对氧化应激造成的内皮祖细胞损伤具有一定的保护作用。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。