一种高效提取沉积物中胞外DNA的方法与流程

本发明涉及一种环境样品特别是沉积物样品中微生物胞外DNA的简易提取方法，该方法借助生物技术手段，对沉积物样品进行处理，属于环境科学与生物工程技术领域。

背景技术：

抗生素抗性基因在自然环境中广泛的存在和传播扩散引起了巨大的环境和健康风险，有必要对自然环境中抗性基因的数量进行准确地检测。环境中的抗生素抗性基因通常位于一些可移动遗传元件上，如质粒、整合子、转座子等，这些抗性基因可以通过可移动遗传元件的水平转移进行传播和扩散。位于细菌内的抗生素抗性基因通常可以通过结合和转导进入其他细菌，而位于细菌体外的基因则有可能通过转化再次进入细菌体内。细胞内和细胞外的抗生素抗性基因通过不同的方式对抗生素抗性基因的传播和扩散起到不同的作用，因此，对细胞内和细胞外DNA加以区分对于研究抗生素抗性基因在环境中的传播扩散尤为重要。

目前对于胞外DNA(eDNA)的提取方法主要有苯酚-氯仿抽提法、微柱吸附法、磁珠吸附法等，但这些方法主要针对组织和血浆中胞外DNA的提取。沉积物介质基质复杂，干扰严重，现有方法无法直接用于沉积物中eDNA的提取，因此建立一种高效的沉积物样品DNA提取方法至关重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种对于环境样本中微生物胞外DNA的提取的方法，以解决目前环境样本胞外DNA提取方法的欠缺。依据本发明方法可以对沉积物等环境样本中的胞外DNA进行快速有效地提取，能得到可直接用于后续分子生物学操作的高纯度DNA，并且可以计算DNA的提取效率。本发明关于提取效率的创造性之处在于向未经灭菌的土壤样品中直接加入内标胞外DNA。

本发明提供的从沉积物样品中高效提取胞外DNA的简易方法，对于不同的土壤和水体沉积物样品均具有较好的胞外DNA提取效果，并且该方法引入了DNA提取效率的指标，该指标是指通过在待提取的土壤样品中加入已知数量的内标胞外DNA CESA9。CESA9是拟南芥中一段纤维素合成酶基因，在对环境样本提取胞外DNA之后，对该基因进行实时荧光定量PCR确定其拷贝数量，以此计算出DNA的提取效率。加入内标胞外DNA之前的沉积物样品DNA经过PCR反应检测不到目的基因CESA9的存在。

本发明提供的高效提取沉积物中胞外DNA方法的具体步骤为：

第1：胞外DNA内标基因的构建；

第1.1：胞外DNA内标基因克隆载体的构建；

CESA9是拟南芥中一段纤维素合成酶基因，该基因片段作为计算胞外DNA提取的内标基因，将这段基因用PCR扩增之后进行切胶回收，取0.5-4μl PCR与1μl pEASY-T1克隆载体轻轻混合，室温反应5分钟，反应结束后，将离心管置于冰上；

第1.2：胞外DNA内标基因的扩增

加连接产物于50μl感受态细胞E.coli DH5α中，42℃水浴热激30秒，立即置于冰上2分钟；加入250μl平衡至室温的LB培养基，200rpm、37℃培养1小时；取8μl 500mM IPTG和40μl 20mg/ml X-gal混合，均匀地涂布在准备好的平板上，37℃培养箱中放置30分钟。待IPTG和X-gal被吸收后，取200μl菌液均匀地涂布在平板上，在37℃培养箱中过夜培养；挑选白色克隆接种于LB/AMP+或LB/Kan+的液体培养基中，200rpm、37℃培养6小时左右；用试剂盒小量提取质粒；

第1.3：胞外DNA内标基因浓度的确定：

对第1.2步提取的质粒用核酸浓度测定仪进行测定，确定内标基因浓度；

第2：沉积物样品胞外DNA提取；

第2.1：沉积物样品胞外DNA的分离；

称取1g沉积物样品于10mL无菌离心管中，取10μg第1.2步提取的内标质粒加入到样品中，浓度为2.37×10¹³CFU/g沉积物；加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH₂PO₄溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，混合均匀，250rpm、25℃反应10分钟；然后在4℃条件下，10000×g离心10分钟，取上清液，过0.22μm PVDF滤膜，将滤液存放于冰上；向离心管剩余沉淀中再次加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH₂PO₄溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，按上述过程操作，重复两次之后，将三次所得滤液混合；将滤液在4℃条件下，10000×g离心20分钟，上清液转移至新的无菌管中；

第2.2：胞外DNA溶液的获得；

向第2.1得到的液体中加入1体积的混合溶液，包括50mM Tris-HCl、10mM EDTA和质量浓度为1％的CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)，pH＝8.0，65℃水浴30分钟，4℃条件下，5000×g离心10分钟，弃上清液；再向离心管中加入1体积的高盐度的TE缓冲液A重悬10分钟，所述TE缓冲液A中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA和1M NaCl，pH＝8.0；加入0.6体积的冰异丙醇，在冰上反应1小时，4℃、10000×g离心10分钟；将沉淀再次重悬于1体积TE缓冲液B，所述TE缓冲液B中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA，pH＝8.0；加入等体积的体积比为苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1的混合液，上下颠倒混匀进行抽提，在4℃下10000×g离心10分钟，取上层液体置于新的2mL无菌离心管中，重复此操作一次；用体积比为氯仿：异戊醇＝24:1的混合液再抽提新获得的上层液体一次，4℃下10000×g离心10分钟，取出上层液体，置于1.5mL的无菌离心管中；

第2.3：粗DNA的纯化溶解；

向第2.2步得到的液体中加入0.1倍体积的2M NaCl溶液和0.6倍体积的异丙醇，-20℃时静置60分钟，10000×g离心15分钟，弃去上清液，用0.5mL体积比为70％的冷乙醇洗涤沉淀，吹打使DNA浮起，10000×g离心2分钟，重复洗涤一次，弃去乙醇后将DNA在真空中进行干燥；用30μL的65℃预热的TE缓冲液溶解DNA，TE缓冲液为pH＝8.0的10mM Tris-HCl和1mM EDTA混合溶液；

第3：内标基因的定量；

利用实时荧光定量PCR检测提取的DNA中所含内标基因CESA9的拷贝数量。实时荧光定量PCR的引物序列及退火温度见实施例2。

用于计算DNA提取效率的内标基因CESA9是拟南芥中一段纤维素合成酶基因，在所要提取DNA的环境样品中检测不到。

本发明的优点和积极效果：

本发明所述方法可以将环境样本中胞外DNA进行分离与纯化。通过紫外分光光度计检测，提取出的DNA的OD260/OD280可以达到1.57，OD260/OD230可以达到1.78，可以进行后续的分子操作，实用性较强。通过DNA的提取效率分析，该方法的沉积物中胞外DNA提取率可以达到57％，表明该方法可靠性程度较高。

具体实施方式

实施例1：沉积物样品中胞外DNA的提取；

第1：胞外DNA内标基因的构建；

第1.1：胞外DNA内标基因克隆载体的构建；

将拟南芥中CESA9基因用PCR扩增之后进行切胶回收，取0.5-4μl PCR与1μl pEASY-T1克隆载体轻轻混合，室温反应5分钟，反应结束后，将离心管置于冰上；

第1.2：胞外DNA内标基因的扩增

加连接产物于50μl感受态细胞E.coli DH5α中，42℃水浴热激30秒，立即置于冰上2分钟；加入250μl平衡至室温的LB培养基，200rpm、37℃培养1小时；取8μl 500mM IPTG和40μl 20mg/ml X-gal混合，均匀地涂布在准备好的平板上，37℃培养箱中放置30分钟。待IPTG和X-gal被吸收后，取200μl菌液均匀地涂布在平板上，在37℃培养箱中过夜培养；挑选白色克隆接种于LB/AMP+或LB/Kan+的液体培养基中，200rpm、37℃培养6小时左右；用试剂盒小量提取质粒；

第1.3：胞外DNA内标基因浓度的确定：

对第1.2步提取的质粒用核酸浓度测定仪进行测定，确定内标基因浓度；

第2：沉积物样品胞外DNA提取；

第2.1：沉积物样品胞外DNA的分离；

称取1g沉积物样品于10mL无菌离心管中，取10μg第1.2步提取的内标质粒加入到样品中，浓度为2.37×10¹³CFU/g沉积物；加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH₂PO₄溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，混合均匀，250rpm、25℃反应10分钟；然后在4℃条件下，10000×g离心10分钟，取上清液，过0.22μm PVDF滤膜，将滤液存放于冰上；向离心管剩余沉淀中再次加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH₂PO₄溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，按上述过程操作，重复两次之后，将三次所得滤液混合；将滤液在4℃条件下，10000×g离心20分钟，上清液转移至新的无菌管中；

第2.2：胞外DNA溶液的获得；

向第2.1得到的液体中加入1体积的混合溶液，包括50mM Tris-HCl、10mM EDTA和质量浓度为1％的CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)，pH＝8.0，65℃水浴30分钟，4℃条件下，5000×g离心10分钟，弃上清液；再向离心管中加入1体积的高盐度的TE缓冲液A重悬10分钟，所述TE缓冲液A中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA和1M NaCl，pH＝8.0；加入0.6体积的冰异丙醇，在冰上反应1小时，4℃、10000×g离心10分钟；将沉淀再次重悬于1体积TE缓冲液B，所述TE缓冲液B中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA，pH＝8.0；加入等体积的体积比为苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1的混合液，上下颠倒混匀进行抽提，在4℃下10000×g离心10分钟，取上层液体置于新的2mL无菌离心管中，重复此操作一次；用体积比为氯仿：异戊醇＝24:1的混合液再抽提新获得的上层液体一次，4℃下10000×g离心10分钟，取出上层液体，置于1.5mL的无菌离心管中；

第2.3：粗DNA的纯化溶解；

向第2.2步得到的液体中加入0.1倍体积的2M NaCl溶液和0.6倍体积的异丙醇，-20℃时静置60分钟，10000×g离心15分钟，弃去上清液，用0.5mL体积比为70％的冷乙醇洗涤沉淀，吹打使DNA浮起，10000×g离心2分钟，重复洗涤一次，弃去乙醇后将DNA在真空中进行干燥；用30μL的65℃预热的TE缓冲液溶解DNA，TE缓冲液为pH＝8.0的10mM Tris-HCl和1mM EDTA混合溶液；

第3：提取胞外DNA质量检测；

利用核酸蛋白检测仪对所提取的DNA进行OD260/OD280、OD260/OD230的测定。

利用实施例1所述方法提取来自沉积物样品中的微生物胞外DNA。利用核酸蛋白检测仪对所提取的DNA进行OD260/OD280、OD260/OD230的测定，结果见表1。结果显示用本发明中的方法提取来自沉积物中的胞外DNA其OD260/OD280值接近1.30，说明提取样品中蛋白质残留较少；其OD260/OD230值不低于1.60，说明腐殖酸类等的其它杂质少；因此，本发明适合提取沉积物样品中微生物胞外DNA。此外本发明的应用范围不仅包括沉积物，对于土壤等介质提取的DNA质量较高。

表1：提取沉积物样品中微生物胞外DNA纯度检测

实施例2：PCR检验沉积物中微生物胞外DNA提取效率；

(1)目的基因引物序列

(2)定性PCR反应程序

(3)荧光实时定量PCR反应

(4)定性PCR反应体系

(5)定量PCR反应体系

表2：提取沉积物样品中微生物胞外DNA提取效率检测

利用实施例2所述方法检测可得对沉积物样品中的微生物胞外DNA的提取效率均高于44％，最高可达57％。因此，本发明适合提取沉积物样品中微生物胞外DNA。此外本发明的应用范围不仅包括沉积物，对于土壤等介质提取的DNA质量和提取效率也较高。