本发明涉及生物技术领域，涉及一种人蛔虫单个虫卵DNA扩增的方法。
背景技术：
人蛔虫（Ascaris lumbricoides Linnaeus，1758），隶属于线虫动物门、尾感器纲、蛔虫目、蛔虫属。是人体最常见的肠道寄生虫之一，尤其是儿童，寄生于人体小肠内，引起蛔虫病，属大型的人体寄生线虫。成熟的雌虫和雄虫在小肠里交配产卵。受精卵随病人的粪便排出体出外，并在适宜的条件下发育，它能使人感染上蛔虫病，叫做感染性卵。如果这种感染性卵随食物或其他途径进入人体，在十二指肠中孵出幼虫，幼虫钻入肠壁血管，随血液经肝、心、肺等器官，然后经气管至咽部，再被吞噬经食道到达胃和小肠，在小肠定居发育成成虫。人蛔虫对是全球流行地域最广、感染人数最多的病原生物之一，对人类健康造成严重危害，如机械性损伤、超敏反应、营养不良、肠功能障碍等，许多国家已将人蛔虫纳入公共卫生学范畴。
对于任何一种微量DNA的直接扩增，基因组DNA的释放是决定DNA扩增是否成功的关键因素之一，人蛔虫虫卵的特别之处在于该蛔虫的虫卵有一层坚硬、质密的蛋白质外壳和抗渗透性脂质层，使虫卵对各种理化物质和不良的外界环境具有很强的抵抗力，但给虫卵基因组DNA的释放造成了一定的影响。同时，人蛔虫虫卵基因组DNA含量少，抽提DNA的难度非常大。因此，建立一种高效、稳定免提取直接扩增人蛔虫单个虫卵DNA的方法是人蛔虫病诊断和防治工作中的关键。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种免提取直接扩增人蛔虫单个虫卵DNA的方法。
本发明是通过以下技术方案实现。
本发明所述的一种免提取直接扩增人蛔虫单个虫卵DNA的方法，包括以下步骤。
（1）蒸馏水洗虫卵。用离心管，加入蒸馏水和虫卵，3200rpm漩涡震荡1-2min后，10000r/min离心2-5min，弃上清液，反复3次。显微镜下挑取一个虫卵于事先装有2个研磨球（PowerBead）及5μl高纯水的0.2ml的PCR管中。
（2）破碎虫卵。将装有研磨球的PCR管于100℃沸水和-80℃或液氮中交替放置lmin，经过6-9次的反复充分冻融后，水平放在漩涡震荡仪上3200rpm 震荡10-15min。
（3）PCR扩增。吸取PCR反应液于PCR管中进行扩增。PCR反应液的配方为：Premix Taq Version2.0 (Takara)，上、下游引物各0.2-0.5 μM，高纯水。反应条件为94℃预变性5分钟，先进行5个循环的高温PCR：94℃变性45秒，53-55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，再进行30-35个循环的低温PCR：94℃变性45秒，45-47℃退火30秒，72℃延伸1分钟，最后72℃延伸7分钟。
（4）结果检测。取出少量PCR产物，经凝胶电泳检测，用凝胶成像系统观察结果，如图1所示，观察到目的条带，说明扩增成功。
本发明的优点是：用本发明用于扩增的人蛔虫虫卵在整个实验过程中始终在同一PCR管中，可减少转移过程中虫卵的丢失和DNA的损失；本发明破碎虫卵，以反复冻融和PowerBead漩涡震荡的方式代替通常的研磨，可在显微镜下可观察虫卵蛋白质外壳破裂，使DNA暴露出来；本发明省去了常规方法中氯仿抽提蛋白质、异丙醇沉淀DNA等基因组DNA提取步骤，是一种安全、低毒、环境友好型的基因组DNA提取方法；本发明为人蛔虫的分子流行病学、遗传多样性、遗传结构、系统发生学、谱系地理学研究提供重要的技术方法，对人蛔虫病的分子诊断和防控也有重要意义。
附图说明
图1 用本发明扩增的电泳图谱。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步地说明。
实施例1。一种免提取直接扩增人蛔虫单个虫卵DNA的方法如下。
1、蒸馏水洗虫卵。
用1.5ml离心管，加入蒸馏水和虫卵，3200rpm漩涡震荡1min后，10000r/min离心2min，弃上清液，如此反复3次。显微镜下挑取一个虫卵于事先装有2个PowerBead及5μl高纯水的0.2ml的PCR管中。
2、破碎虫卵。
将装有PowerBead的PCR管于100℃沸水和-80℃中交替放置lmin，经过6次的反复充分冻融后，水平放在漩涡震荡仪上3200rpm 震荡10min。
3、PCR扩增。
吸取15μlPCR反应液于PCR管中进行扩增。PCR反应液的配方为：Premix TaqVersion2.0 (Takara) 10μl，上、下游引物各0.2 μM即各1.5μl，高纯水2μl。反应条件为94℃预变性5分钟，先进行5个循环的高温PCR：94℃变性45秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，再进行30个循环的低温PCR：94℃变性45秒，45℃退火30秒，72℃延伸1分钟，最后72℃延伸7分钟。
4、结果检测。
取出5μl PCR产物，经2%的凝胶电泳检测，用凝胶成像系统观察结果，如图1所示，观察到目的条带，说明扩增成功。