本发明涉及高粱红曲菌M-3原生质体制备方法。
背景技术：
红曲菌是一种典型的红曲霉属丝状真菌，早在我国的古籍中就有记载。红曲菌能够在发酵培养的过程中产生多种次级代谢产物， 有一定的保健活性，具有降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病及抗癌等作用。但已有研究发现，一些红曲菌菌株在发酵培养的过程中会产生桔霉素，对人畜均有一定的毒害作用，这种真菌毒素的产生很难通过改变发酵条件或者菌株筛选等来抑制。
福建农林大学前期从福建传统红曲中分离筛选到1株高产红曲色素的红曲霉菌株，经形态学、生理生化以及分子生物学研究被鉴定为高粱红曲菌。然而，这株高粱红曲菌菌株同样也高产桔霉素，通过发酵培养基和发酵工艺条件的优化至今仍无法将其桔霉素的产量降低到安全水平，从而限制了这株功能性红曲菌的应用。若能利用现代生物学技术和先进的分析方法，如通过细胞融合技术构建一种能够高产色素，不产桔霉素或低产桔霉素的红曲霉菌株，解决红曲菌在发酵的过程中高产桔霉素的问题，将有利于拓展功能性红曲的应用范围。
原生质体是丝状真菌进行细胞的融合以及遗传转化的重要工具，是分子遗传研究的基础，国内外很多学者都是在原生质体基础上进行遗传转化，关于原生质体的制备与再生已有大量相关文献报道，但未涉及高粱红曲菌原生质体制备以及再生方法的研究。目前，原生质体的制备已有的研究绝大部分是利用复合裂解酶去除细胞壁，但是由于不同种类的微生物，其细胞壁组成各有差异，从而导致其原生质体制备的条件也各不相同。在原生质体制备的过程中，渗透压稳定剂的作用是维持原生质体膜系统渗透压的平衡，有效防止原生质体破裂、失活，因此渗透压稳定剂对原生质体的形成和再生都有重要的作用。其次，酶解是原生质体制备与再生过程中的关键环节，在细胞壁降解的过程中，生成的原生质体被释放到在含各种裂解酶的渗透压稳定剂中，其膜质系统容易受到破坏，导致原生质体难以再生、甚至失活，因此酶解条件（时间、ｐH 值、温度等） 对得到理想的原生质体具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明提出一种高粱红曲菌M-3原生质体制备方法。
一种高粱红曲菌M-3原生质体制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）取纤维素酶、蜗牛酶、山梨醇、柠檬酸、磷酸氢二钠、高渗透稳定液、山梨醇、酶解液备用，以上原料均为市售；
（2）取高粱红曲菌M-3在摇床上以200转/分钟的速度，培养，温度为30℃，培养时间为60小时；
（3）收集菌丝体，置于50毫升的无菌离心管中，以高渗透稳定液洗涤，并于4000转/分钟的速度，在4℃离心10分钟获得沉淀物，按质量体积比为1∶30的人比例加入裂解酶液，在30℃，以120转/分钟的振荡酶解3小时，然后离心取沉淀；
（4）用高渗透稳定液洗涤2次除去酶液，用血球计数板计数，最后再次离心，得到沉淀物即原生质体。
优选地，高渗透稳定液为1摩尔/升山梨醇。
优选地，所述酶解液为在PH8.0的50mmol/Lde trips缓冲液中各加入0.3％的纤维素酶和0.3％的蜗牛酶,在4℃低温保藏。
优选地，所述缓冲液的配制为rHYL4的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液与C6H8O·7H2O混合。
本发明所述高粱红曲菌M-3原生质体制备方法，原生质体形成数为3000000个/毫升，原生质体原生质体再生率19.33％，再生菌落数为5800000个/毫升。
具体实施方式
实施例1。
一种高粱红曲菌M-3原生质体制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）取纤维素酶、蜗牛酶、山梨醇、柠檬酸、磷酸氢二钠、高渗透稳定液、山梨醇、酶解液备用，以上原料均为市售；
（2）取高粱红曲菌M-3在摇床上以200转/分钟的速度，培养，温度为30℃，培养时间为60小时；
（3）收集菌丝体，置于50毫升的无菌离心管中，以高渗透稳定液洗涤，并于4000转/分钟的速度，在4℃离心10分钟获得沉淀物，按质量体积比为1∶30的人比例加入裂解酶液，在30℃，以120转/分钟的振荡酶解3小时，然后离心取沉淀；
（4）用高渗透稳定液洗涤2次除去酶液，用血球计数板计数，最后再次离心，得到沉淀物即原生质体。
实施例2。
一种高粱红曲菌M-3原生质体制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）取纤维素酶、蜗牛酶、山梨醇、柠檬酸、磷酸氢二钠、高渗透稳定液、山梨醇、酶解液备用，以上原料均为市售；
（2）取高粱红曲菌M-3在摇床上以200转/分钟的速度，培养，温度为30℃，培养时间为60小时；
（3）收集菌丝体，置于50毫升的无菌离心管中，以高渗透稳定液洗涤，并于4000转/分钟的速度，在4℃离心10分钟获得沉淀物，按质量体积比为1∶30的人比例加入裂解酶液，在30℃，以120转/分钟的振荡酶解3小时，然后离心取沉淀；
（4）用高渗透稳定液洗涤2次除去酶液，用血球计数板计数，最后再次离心，得到沉淀物即原生质体。
（5）所述高渗透稳定液为1摩尔/升山梨醇。
实施例3。
一种高粱红曲菌M-3原生质体制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）取纤维素酶、蜗牛酶、山梨醇、柠檬酸、磷酸氢二钠、高渗透稳定液、山梨醇、酶解液备用，以上原料均为市售；
（2）取高粱红曲菌M-3在摇床上以200转/分钟的速度，培养，温度为30℃，培养时间为60小时；
（3）收集菌丝体，置于50毫升的无菌离心管中，以高渗透稳定液洗涤，并于4000转/分钟的速度，在4℃离心10分钟获得沉淀物，按质量体积比为1∶30的人比例加入裂解酶液，在30℃，以120转/分钟的振荡酶解3小时，然后离心取沉淀；
（4）用高渗透稳定液洗涤2次除去酶液，用血球计数板计数，最后再次离心，得到沉淀物即原生质体。
（5）所述高渗透稳定液为1摩尔/升山梨醇；所述酶解液为在PH8.0的50mmol/Lde trips缓冲液中各加入0.3％的纤维素酶和0.3％的蜗牛酶,在4℃低温保藏；所述缓冲液的配制为rHYL4的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液与C6H8O·7H2O混合。