本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻茎秆发育相关基因，以及该基因编码的蛋白质。
背景技术：
：水稻茎秆不仅关系到生物合成产物的运输，而且它的粗细刚柔与水稻的抗倒性有直接关系，通常茎秆越粗、茎壁厚度越厚，其抗倒性越强(饶玉春等.中国稻米.2009(06):15-19)。因此，发掘茎秆粗细和结构相关基因对水稻抗倒伏性育种有重要意义。目前已有45个与茎秆发育相关的基因被克隆。影响水稻茎秆直径与茎壁厚度的基因主要分为两大类，一类是与次生细胞壁合成直接相关的基因，如编码纤维素合酶催化亚基基因OsCesA4(BC7)、OsCesA9(BC6)参与纤维素的合成(KatsuyukiTanaka,PlantPhysiology,2003,133)，编码糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白基因BrittleCulm1(BC1)影响纤维素的结晶度等(LifengLiu,PLoSGenetics,2013)。另一类是与植物激素信号合成与转导途径相关的基因，如编码一个具有转录激活活性的R2R3型MYB转录因子基因OsMYB103L，编码一个赤霉素受体GID1基因，介导水稻中GA的信号传导。经检索，没有发现能同时调控水稻茎壁厚度和生育期的基因的报道。技术实现要素：本发明人在籼稻重穗型恢复系蜀恢498所构建EMS(甲基磺酸乙酯)诱变库中意外发现一份茎秆明显变细、易倒伏，同时具有株高稍矮、叶尖枯萎等性状的突变体ss1(slimstem1)。经研究发现该性状由水稻茎秆直径和茎壁厚度的新基因所控制。本发明在此基础上完成。本发明的目的在于提供一种控制水稻茎秆发育相关的蛋白质。本发明另一目的在于提供编码上述蛋白质的基因。该基因能控制水稻茎秆细胞数目，可利用该基因调控茎秆的直径以及茎壁厚度提高植株抗倒伏能力，实现水稻品种改良。本发明第三目的在于提供上述基因在水稻茎秆改良上的用途。本发明提供一种控制水稻茎秆发育相关的蛋白质，是如下(1)或(2)：(1)由序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成；(2)对序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列进行添加、取代或缺失一个或几个氨基酸而衍生的、具有与(1)相同的控制水稻茎秆发育功能的蛋白质。本发明还提供了编码上述蛋白质的基因，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列组成；(b)对序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列进行添加、取代缺失一个或几个核苷酸而生成的、且编码与(a)相同的控制水稻茎秆发育功能蛋白质的核苷酸序列。上述基因可以通过人工合成，或者以突变体ss1的总DNA为模板，利用PCR技术扩增而得。上述基因在提高水稻茎秆直径、水稻茎壁厚度或增强水稻抗倒伏能力上的应用。本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明编码基因为一个控制水稻茎秆直径和茎壁厚度的新基因，为水稻茎秆改良提供了一个新途径。(2)本发明编码基因可用于水稻育种中对水稻抗倒伏性材料筛选，以及用于杂交育种后代材料抗倒伏性的早期鉴定和筛选。(3)为水稻抗倒伏性基因的研究提供了一个很好地基础，并可用于水稻抗倒伏新育种材料的创制中。附图说明图1、分蘖初期蜀恢498和突变体ss1表型对比照片；其中1为蜀恢498；2为突变体ss1。图2、抽穗期蜀恢498和突变体ss1表型对比照片；其中1为蜀恢498；2为突变体ss1。图3、植株茎秆对比照片：其中1为蜀恢498；2为突变体ss1。图4、蜀恢498茎秆细胞显微照片。图5、突变体ss1茎秆细胞显微照片。图6、分子标记RM16的电泳图谱；其中1为日本晴；2为突变体ss1；3为交换单株。图7、分子标记RM168的电泳图谱；其中1为日本晴；2为突变体ss1；3为交换单株。图8、早衰候选基因的初步定位示意图。图9、Crispr/Cas9载体示意图。图10、转Crispr/Cas9基因编辑阳性植株的照片；其中1为阴性对照；2，基因编辑植株；3为基因编辑植株。图11、引物PCR扩增产物Sac1酶切后的电泳图谱：其中1为DNAMarker；2为野生型kitaake；3为基因编辑纯合植株；4为基因编辑杂合植株。具体实施方式实施例1:突变体分离与遗传分析试验按照如下方法进行：(一)试验材料突变体ss1,日本晴和蜀恢498均来源于四川农业大学水稻研究所杂种优势利用实验室。(二)试验方法(1)2014年夏天，在四川农业大学水稻研究所温江试验场种植蜀恢498、突变体ss1，每区4行，每行12株，栽插规格，16.7cm×33.3cm，3次重复，田间管理按照一般大田进行，考察株高、茎秆直径等农艺性状。(2)利用突变体ss1与日本晴以及蜀恢498分别构建F2群体，统计F2群体的分离比。表型分析结果：与野生型相比，突变体ss1在分蘖期开始部分叶片出现叶尖枯黄表型(见图1)，到孕穗期以及灌浆期后，突变体株高变矮、叶尖萎焉、茎秆变细(见图2)。表1.突变体遗传分析结果杂交组合正常植株突变植株总数χ2(3:1)Pvaluess1/日本晴127491760.7580.30-0.50ss1/蜀恢498178622400.090.80-0.70注：χ20.05,1＝3.84遗传分析结果：利用突变体ss1分别与日本晴和蜀恢498分别杂交获得F1(12株)，F1代植株均具有正常的叶片表型和生育期；经卡方检验，F2代中的野生型和突变体茎秆粗细表型的分离比(见表1)符合孟德尔单基因隐性突变的分离比3:1，说明突变体ss1是受单隐性基因控制。实施例2：茎秆细胞半薄切片观察试验(一)试验材料和方法1)取野生型蜀恢948与突变体ss1旗叶中间部位材料，用2.5％的戊二醛溶液(用0.05M的PBS配制)固定48小时左右；2)固定好之后用蒸馏水冲洗3次每次大约5-10分钟；3)再用1％的锇酸(用0.2M的PBS配置)固定2-4小时；4)用蒸馏水冲洗3次每次大约5-10分钟；5)脱水：30％的丙酮0.5小时；50％的丙酮0.5小时；70％的丙酮0.5小时；85％的丙酮0.5小时；95％的丙酮0.5小时；100％丙酮3次共2小时；6)渗透：2/3丙酮+1/3Epon812反应6小时；1/3丙酮+2/3Epon812反应6小时；纯Epon812要渗透3次每次12小时；(以上反应都在干燥器中进行)7)包埋聚合：在烘箱中37°聚合24小时；之后70°聚合48小时；8)切片观察并照相：用LeicaRM2265切成2-4μM厚度的片子，用OLYMPUSBX41观察并照相。Epon812包埋剂配方(30ml)：Epon81230ml，DDSA(十二烷基琥珀酸酐)8ml，NMA(甲基丙次甲基邻苯二甲酸酐)7ml，DMP-30(2﹑4﹑6-三甲基氨甲基苯酚)7-8滴。这些试剂必须按顺序加入，每次加入一种试剂都要混匀5-10分钟；最后一种试剂每加两滴就要混匀5-10分钟。结果与野生型蜀恢498(见图4)相比，突变体ss1(见图5)茎秆细胞明显变短、变窄，是导致茎秆变细的主要原因。实施例3:突变体ss1候选基因定位(一)试验材料和方法1.近等基因池的构建从突变体ss1与日本晴杂交而得到F2群体中，随机选取45株细杆表型的单株叶片和15份野生型单株叶片，每15株的叶片等量混合提取DNA建池，包括3个隐性池和1个显性池用于候选基因初定位。叶片DNA的提取采用改进CTAB法。2.引物的合成和基因定位通过遗传分析，选择(ss1/日本晴)的F2群体中750株隐性单株作为初定位群体。首先选取平均覆盖了水稻所有12条染色体的250对SSR引物进行多态性筛选，从中筛选出了在12条染色体上都有分布的45对多态性引物。并对38多态性引物在3个隐性池和1个显性池中进行筛选。结果发现3号染色体上的标记RM7与突变体表型有一定的连锁关系，3.候选基因精细定位进一步扩大群体，将杂交组合(ss1/日本晴)F2代中共1200株隐性单株作图群体进行候选基因精细定位。根据突变体ss1与日本晴背景上存在籼粳稻的差异，在RM16与RM168区间内开发INDEL和SSR分子标记(水稻基因组序列由GRAMENE数据库获取，见表2)，通过各标记在作图群体上交换单株的对比分析，进一步精细定位候选基因。表2本试验中所涉及的定位引物名称前引物后引物RM7TTCAACCTGCATCCGCTCCCATCCAAATCAGCAACAGCRM16TCTGATCTTGATGCAGGCACTCTCCCGATTTGGACAGATCRM168TGTCGTCGAGGATTTGGAGATCGGAATCAATCCACGGCACAGTCCF98CGGCTTCCTTAGGGCTAGTGAGGGAGGGATTCGAGGGF99CTATGAGGCTCTGATGATTGATGTATCTACAAGGGTT所用的PCR反应体系为(20μl)：Tap酶(5U/μL)0.2uL，Primer(10mmol/L)2uL，dNTP(2.5mmol/L)2uL，DNA(20-100ng/μL)2uL，10×Buffer(25mM)2uL，ddH2O11.8uL。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃8min；20℃2min。电泳检测：在3.0％的琼脂糖凝胶、恒压120-150V电泳2-3h左右，用凝胶成像系统成像。4.连锁图谱的构建将带型为突变体的单株标记为0，带型为杂合的单株记为1，带型为亲本的单株记为2，未出带的单株记为3，通过用MAPMARKER3.0软件对F2分离群体中分子标记和突变性状的分离数据进行连锁分析，再将重组值转化为遗传图距(CentMorgan,cM)。结果将ss1候选基因初步定位在水稻3号染色体上的长臂端，RM16与RM168之间(见图6和图7)，遗传距离为4.9CM(见图8)。通过在该区段内继续开发Indel标记，最终将突变基因初步定位在第3号染色体上F98-F99区段，其间物理距离为48Kb的区间内(见图8)。实施例3:候选基因的克隆与测序验证(一)实验材料与方法浸种催芽蜀恢498和突变体ss1的种子后，在底部垫有湿润滤纸的培养盒中播种，在光照14h/黑暗8h、30℃培养一周后。去掉基部种子的小苗吸干水后,分别提取RNA整株取样,提取后用1％琼脂糖凝胶取1μL检测。1.RNA的提取RNA提取步骤操作是按Trizol试剂说明书。2.cDNA第一条链的合成：按照TOYOBOReverTraAce-aTM说明进行。3.基因片段扩增使用Primer5.0软件，对预测的候选基因LOC_Os03g47010，根据RiceGenomeAnnotationProjec(http://rice.plantbiology.msu.edu/)网站上的参考cDNA序列，分别设计引物，以上一步分别反转录得到的蜀恢498和突变体ss1的cDNA为模板，进行PCR扩增，得PCR扩增产物(见图7)；PCR反应条件如下:基因扩增的PCR反应体系(50μL)：cDNA模板1μL，dNTPMixture(2.0mM)5μL，10×PCRbuffer5μL，MgSO4(25Mm)2μL，Primers15pmoleseach，KOD-Plus(1U/μl)1μL，ddH2Oto50μL。PCR反应程序：94℃5min；94℃15s，68℃1min，30个循环；72℃5min。所述的引物为：47010cDNAF5'-TTGGTTGTGATCGACGAGCTAG-3'47010cDNAR5'-CACGGTGATGTTGAGCACGAGCGG-3'4.纯化和回收PCR产物目的DNA片断胶回收操作步骤参照OmegaGelExtractionKit产品说明书进行：取2μL胶回收产物置于1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，检测后放入-20℃保存。5.基因目的片段与克隆载体的连接连接体系如下(5μL)：目的片段2-4.5μL，pEASY-Blunt载体0.5μL。将经胶回收而来的蜀恢498和突变体ss1的cDNA片段，按上述体系连接到克隆载体。一般情况下，目的片段溶液：载体溶液(V/V)＝3：1至10：1，连接体系25℃条件下反应30分钟。6.大肠杆菌转化大肠杆菌转化详见相关产品说明(TIANGENG,CE080530)。7.大肠杆菌质粒的提取大肠杆菌质粒提取的方法(参照OMEGAPlasmidExtractionKit产品说明书)：质粒DNA收集到干净的离心管中，-20℃保存。8.DNA序列的测定和序列分析阳性克隆质粒由成都擎科科技股份有限公司进行测序，并分析扩增目的片段在蜀恢498和突变体ss1之间的差异。根据精细定位的结果，对该区间的8个预测基因进行分析，在LOC_OS03g47010中第80个碱基由C突变为T，从而导致编码的氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸，影响该基因编码蛋白的生物学功能(见图9)。基因为全长2271个碱基、含有3外显子，是糖苷水解酶10家族(GH10)中未报道的新基因，根据基因命名规则定名为OsXYN1。实施例4：候选基因的功能验证(一)实验材料与方法本实验所用大肠杆菌菌株DH5α和农杆菌菌株EH105以及水稻Kitaake品种均来自于四川农业大学水稻研究所杂种优势利用实验室。1、OsXYN1基因编辑载体构建OsXYN1基因功能定点敲除验证构建包含OsXYN1基因编码序列中含有GN19NGG序列特征的Crispr/CAS9载体(如图10所示)。具体方法参照(JiankangZhu,CellResearch(2013):1-4.)文章所述。单克隆鉴定时使用M13引物与47010crispr引物配对进行PCR扩增。2、农杆菌化学转化法1)按照一个质粒：50ul感受态细胞从-80℃拿出来时快速放手心化冻。2)加1ug构建好的Crisper/cas9质粒于50ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。3)液氮中冷冻2分钟。4)37℃水浴2min,溶化细胞。5)立即加入5倍体积的无抗LB培养基，28℃摇床培养2-3hr(170rpm)。6)7000rpm离心2分钟，悬浮细胞在100ulLB培养基中。7)涂在利福平加卡那抗性板，吹干，28℃培养2-3天。8)用分子标记引物进行菌液PCR检测，得到阳性农杆菌单克隆置于-80C保存备用。3.农杆菌浸染法转化水稻(1)愈伤组织的诱导：籼稻Kasalath种子先用75％酒精消毒1分钟，用无菌水漂洗3次，再用40％的次氯酸钠漂洗30分钟，再用无菌水冲洗5次，放置于带滤纸的培养皿中滤干，用镊子接种于MS培养基上，于28℃光培养7天。每7天继代一次。继代2～3次后，挑取生长良好的愈伤组织，把它们继代于预培养基上，28℃暗培养4天。(2)农杆菌菌株的活化：将-80C保存的30ul农杆菌加入3mL含有利福平和卡那霉素的LB液体培养基中，于28℃下振荡培养14h；再取其中1mL于含有利福平和卡那霉素的50mL的LB液体培养基中28℃再振荡培养4h。(3)共培养转化：将活化好的菌液在5000rpm下离心收集菌体，用含有100μM/L乙酰丁香酮的AAM液体培养基30mL重悬菌体，将预先挑好的愈伤组织浸于菌液中20min，吸去多余的菌液，平铺于共培养固体培养基上，28℃暗培养2d。(4)愈伤脱菌培养与愈伤抗性筛选：将共培养2d后的愈伤组织用无菌水冲洗至水澄清，然后用含头孢霉素(500mg/L)的无菌水振荡30min杀菌，将愈伤组织用无菌滤纸或吸水纸彻底吸干，然后接种于选择培养基上培养3周左右。(5)转基因植株的分化与生根：将上述新长出的抗性愈伤组织接种到分化培养基上，光照培养1-2个月，然后将长出的3cm左右高的幼苗转到生根培养基上进行生根培养，当苗长至约10cm时，取叶片提DNA利用潮霉素引物鉴定阳性植株苗。(6)将阳性转基因植株室内炼苗后，再移栽于大田。PCR反应体系(10μL)：cDNA模板：1μL，ddH2O：3μL，Primers：1μL，Supermix：5μL。PCR反应程序：95℃1min；95℃15s，58℃30s，40个循环；60℃-98℃0.5℃/s。4.Crispr/Cas9编辑位点DNA扩增片段的酶切检测与测序分析分别提取野生型以及两株阳性转基因植株的DNA，用47010Cas9seq引物扩增包含基因编辑位点的DNA片段。取1ulPCR溶液进行电泳检测特异性，进一步取PCR溶液5ul，加入Sac1限制性内切酶，37℃孵育3小时，进行琼脂糖凝胶电泳，浓度为3％。纯化以上剩余PCR产物，用相应的扩增引物进行测序分析，相关方法见实施例3表3本试验中用到的引物名称前引物(5'-3')后引物(5'-3')47010crisprgtgtGGTTCGGGAACGAGCTCAAGaaacCTTGAGCTCGTTCCCGAACCM13GTAAAACGACGGCCAGTGAGGAAACAGCTATGACCATGHPTTACACAGGCCATCGGTCCAGATAGGAGGGCGTGGATATGTC47010Cas9seqATGCGGACCAACATGGACAAGTCCACCTCCCAGAAGATGC结果获得的转基因植株表现出与突变体ss1类似的表型(见图10)。根据设计的GN19NGG位点中含有Sac1限制性内切酶识别序列，检测转基因敲出植株中该位点的突变情况，野生型PCR扩增产物被切割，而限制性识别序列被破坏的转基因植株PCR扩增产物不能被切割(见图11)。综上所述，经OsXYN1的基因编辑实验验证，OsXYN1是调控水稻茎秆直径和株高的基因。以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页1 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