本发明涉及微生物技术及污水处理技术领域，具体涉及一种副球菌及在污水净化中的应用。
背景技术：
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微生物絮凝剂是微生物在生长过程中分泌的具有絮凝活性的一类高分子聚合物，其主要活性成分有蛋白质、多糖、核酸和菌体。它是利用生物技术，通过发酵而制得的一种具有生物絮凝性和安全性的新型、高效和无毒的廉价水处理菌剂。与传统无机絮凝剂和有机絮凝剂相比，其具有独特的性质：絮凝微生物种类繁多，来源广泛，生长周期短，容易采取现代生物工程技术进行产业化，絮凝成分多是有机分子，可生物降解，避免了对环境二次污染，絮凝效果较强，热稳定性好pH值稳定，特别对重金属离子、有机物和色素去除有特效，生物絮凝剂不仅减轻污水处理系统的负荷，还能够强化水处理生化阶段的微生物活性。因此生物絮凝剂是目前国内外水处理制剂研究的热点，其将部分或全部取代传统絮凝剂是污水处理发展的新趋势。
技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种副球菌，该菌种具有易培养、生长速度快、絮凝效果好和环境适应能力强的特点，其代谢产物对污水具有较好的絮凝效果，为污水治理提供新的菌种。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明的副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1，于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCC No.12826。
本发明还提供了一种微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1接种至发酵培养基中培养得到发酵培养液，所述发酵培养基每升含有：葡萄糖10g，酵母浸膏3g，尿素0.5g，蛋白胨0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.2g，NaCl 0.1g，pH7.5，余量为水；
(2)取步骤(1)得到的发酵培养液，离心去除菌体，取上清液，在其中加入乙醇进行沉淀，收集沉淀得到微生物絮凝剂。
本发明还提供了一种按照上述制备方法制备得到的微生物絮凝剂。
本发明还提供了微生物絮凝剂在污水净化中的应用。
本发明的有益效果如下：本发明提供的菌种具有易培养、生长速度快、絮凝效果好和环境适应能力强的特点，其代谢产物对污水具有较好的絮凝效果，为污水治理提供新的菌种。
副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1，于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCC No.12826。
附图说明：
图1是本发明菌株的全细胞脂肪酸气相色谱图。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1的分离、纯化和鉴定
1、样品采集：细菌样品采自福州某富营养化河道底泥，使用自制底泥采样器采取底泥放入无菌袋，置于4℃冰箱保存。
2、菌种分离
(1)初筛：无菌条件下称取5g底泥，置于带有磁力搅拌子的无菌带塞锥形瓶中，加入质量分数为0.8％无菌生理盐水100mL，在磁力搅拌器上振荡30min，打散菌胶团，制成菌悬液。用已灭菌的移液管吸取5mL，分别加入装有100mL含有牛肉膏蛋白胨的筛选培养基中，28℃、120r/min的摇床上振荡富集培养3-4d。吸取0.5mL培养液，加入质量分数为0.8％无菌生理盐水中，得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6梯度的稀释溶液，吸取不同浓度的稀释溶液各0.2mL涂布于营养琼脂培养基平板上，28℃培养2～3d。挑选单个菌落。经重复3次涂布、挑种，至菌落特征一致，无异常菌落出现者，认为是完全纯化。单菌落接种到营养琼脂斜面培养基上培养、保存。从营养琼脂斜面培养基上挑取少量菌体，接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，28℃、120r/min的摇床上振荡培养3d。各自取2mL发酵液加入装有50mL高岭土悬浮液(4g·L-1)的比色管中。再加入2mL CaCl2溶液(质量分数为1％)，混合均匀，静置10min,目测能使悬浊液絮凝成大颗粒的即为絮凝初筛活性菌株。
所述筛选培养基：牛肉膏5g·L-1，蛋白胨10g·L-1，氯化钠5g·L-1，pH 7.2，121℃高压灭菌15min。
所述营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌15min。
所述发酵培养基：葡萄糖10g·L-1，酵母浸膏3g·L-1，尿素0.5g·L-1，蛋白胨0.5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5g·L-1，KH2PO4 0.2g·L-1，NaCl 0.1g·L-1，pH7.5，溶剂为水，将上述成分按其含量混合均匀后，121℃高压灭菌15min备用。
(2)复筛：将步骤(1)初筛得到的絮凝初筛活性菌株接种于装有50mL发酵培养基的三角瓶中，28℃、120r/min的摇床上振荡培养3-4d。吸取1mL发酵液加入到50mL浓度为0.1g·L-1的高岭土悬浊液中。先激烈搅拌2min，再慢速搅拌5min，最后静置10min，取上清液，用分光光度计测定其在550nm处的吸光度，同时以不添加絮凝剂的蒸馏水作为对照组，均设三个平行样，计算出絮凝率。菌株的絮凝活性使用絮凝率表示，选取絮凝率最高的菌株(絮凝率90％)，将该菌株命名为FIMX-1。
絮凝率＝(N0-N)/N0×100％
其中，N0为对照上清在550nm处的吸光度，N为待测样品上清液在550nm处的吸光度。
3、菌种的鉴定：
取复筛得到的FIMX-1菌株培养至对数生长期的菌液10mL，8000r/min离心15min，倾去上清液，收集菌体。采用CTAB/NaCl法提取菌体基因组DNA。步骤如下：菌体中加入13.5mL TE溶液(pH 8.0)，悬浮，加入3mL 10％(质量分数)十二烷基硫酸钠(SDS)、150μL 100mg/mL溶菌酶和150μL 100mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃水浴1h，加2.5mL 5mol/L NaCl和2mL CTAB/NaCl溶液，混均，65℃水浴10min，以等体积的苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇各抽提3次，异丙醇沉淀DNA，DNA溶于50μL TE中，-20℃保存备用。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性。采用16S rRNA基因的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增后的DNA产物送至上海生物工程有限公司进行测序。用BLAST软件与NCBI的GenBank数据库收录的16S rRNA序列进行比对分析。FIMX-1菌株的16S rRNA(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)与Paracoccus solventivorans strain TLB-6和Paracoccus solventivorans strain TLA-29的16S rRNA基因序列的相似性均为98％，与模式菌株Paracoccus solventivorans strain ATCC 700252和Paracoccus solventivorans strain DSM 6637T相似性为97％。因而确定菌株FIMX-1属于副球菌属(Paracoccus sp.)，命名为副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1。
微生物DNA碱基组成具有种特异性，DNA的(G+C)值在细胞中很稳定，可以作为细菌鉴定重要遗传指标，而且它不受菌龄及突变因素以外的其他因素影响，(G+C)含量分析已成为微生物遗传学分类的一种重要方法，在鉴别细菌种间和种属间关系以及建立一个新的分类单位时具有重要意义。采用高效液相色谱法测定副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1的G+C摩尔分数，副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1的G+C摩尔分数为63.7％(mol％)。副球菌属菌株Paracoccus solventivorans strain TLB-6、Paracoccus solventivorans strain TLA-29、Paracoccus solventivorans strain DSM 6637T、Paracoccus sp.kocurii、Paracoccus sp.G1212、Paracoccus sediminis sp.nov和Paracoccus sp.WB1的G+C摩尔分数分别为65.8％(mol％)、66.0％(mol％)、68.5％(mol％)、71.0％(mol％)、62.0％(mol％)、62.2％(mol％)和68.8％(mol％)。副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1与已经报道的主要的副球菌属菌株的G+C摩尔分数均存在一定的差异。
脂肪酸(fatty acid,FA)作为细胞的基本成份，常以脂化状态存在，组分相对稳定，不同种属的细菌,其脂肪酸的组成和含量表现出不同程度的差异，脂肪酸的种类和数量与细菌的特征、遗传密切相关，细菌脂肪酸的组成与含量中蕴藏了丰富的分类学信息，可作为细菌鉴定的生物标记物之一。若脂肪酸色谱主峰存在明显差别，则提示不同的种或属的细菌，若脂肪酸色谱主峰相似，仅存在峰高的差别，则提示相同的细菌种、不同的菌株。由分析结果可以得出，副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1的脂肪酸种类与含量和大多数副球菌属菌种的脂肪酸的构成相符合。副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1的全细胞脂肪酸的气相色谱分析结果见表1和图1，MIDI数据库比对结果如表1所示。在TSBA6(6.10)数据库中，副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1与Paracoccus-solventivorans和Paracoccus-alkenifer的相似度分别为0.537和0.208。
结合菌株16S rDNA序列比对结果、DNA的G+C摩尔分数和全细胞脂肪酸的气相色谱分析结果，综合确定菌株FIMX-1属副球菌属(Paracoccus sp.)，是副球菌属(Paracoccus sp.)的一个新种，该副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCC No.12826
表1副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1的全细胞脂肪酸的气相色谱结果的参数表
实施例2：微生物絮凝剂制备
所述微生物絮凝剂以所述副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1的代谢产物作为主要活性成分，其制备包括以下步骤：
(1)斜面培养：将实施例1复筛得到的副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1接种至营养琼脂(LB)培养基上，于28℃培养箱培养2～3d得到斜面培养基FIMX-1菌体；所述营养琼脂培养基配方同实施例1。
(2)发酵培养：用接种环挑起少量步骤(1)得到的斜面培养基上的FIMX-1菌体接入发酵培养基中，于28℃、120r/min的摇床上振荡培养2～3d得发酵培养液，所述发酵培养基的配方同实施例1。
(3)微生物絮凝剂的制备：取步骤(2)得到的发酵培养液，4000～5000rpm/min离心，去除菌体，取上清液，加入1.5倍体积的预冷乙醇，离心收集沉淀得到目标产物，即为微生物絮凝剂。
实施例3：所述副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1在污水净化中的应用
(1)对内河污水的净化
内河污水预先经2层纱布过滤去除大颗粒物质。取实施例2制备的微生物絮凝剂(所述副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1的代谢产物作为活性成分)0.15g，加入到50mL内河污水(pH为6.5)中，同时加入0.2mL质量分数为1％的CaCl2溶液。先激烈搅拌2min，再慢速搅拌5min，最后静置10min，取上清液，用分光光度计测定其在550nm处的吸光度，同时以不添加絮凝剂的蒸馏水作为对照组，均设三个平行样，计算出絮凝率。所述微生物絮凝剂对内河污水的絮凝率可达75％(对照组的絮凝率是19％)，副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1对内河污水具有较好的絮凝净化效果。
(2)对养猪污水厌氧出水的净化
取实施例2制备的微生物絮凝剂(所述副球菌(Paracoccus sp.)FIMX-1的代谢产物作为主要活性成分)0.3g，加入到50mL稀释2倍的养猪污水厌氧出水中(pH为8.1)中，同时加入0.2mL质量分数为1％的CaCl2溶液。先激烈搅拌2min,再慢速搅拌5min，最后静置10min，取上清液，用分光光度计测定其在550nm处的吸光度，同时以不添加絮凝剂的蒸馏水作为对照组，均设三个平行样，计算出絮凝率。所述微生物絮凝剂对养猪污水厌氧出水的絮凝率可达51％(对照组的絮凝率是12％)，对养猪污水厌氧出水具有较好的絮凝净化效果。