一种类芽孢杆菌及其在净化水体方面的应用的制作方法

本发明涉及水体净化微生物，具体地说，涉及一种类芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

随着经济的快速发展和城市化的加快，我国许多城市河流水质污染和生态退化问题十分突出，甚至出现了季节性和常年性水体黑臭现象。现有黑臭水体治理方式主要采用植物净化和曝气治理为主，净化负荷低，治理过程需要额外电能投入，运营成本高。

芽孢杆菌是土壤中的优势种群，能强烈地分解碳系、氮系、磷系、硫系污染物，并能分解蛋白质和复杂多糖，对水溶性有机物的分解也有重要的作用，同时可以与养殖环境中的有害藻类及水产致病菌竞争，形成优势种群，抑制有害藻类及水产致病菌。由于它的特性与功能优于光合细菌而有望成为光合细菌的替代品，已成为当前国际净水界研究的热点课题。

公布号为CN103923868B的中国专利公开了一种混合菌群微生物制剂，是由类芽孢杆菌、施氏假单胞菌、假产碱假单胞菌和食油假单胞菌组成的菌悬液，总活菌数为3.8*10⁸CFU/ml以上。所述混合菌群微生物制剂可以用于处理污水，可以加强秋季人工湿地处理受污染河水及城镇生活污水的能力。然而，所述微生物制剂依赖多种微生物的组成而发挥功能，其需要对上述多种微生物进行分离、筛选并富集培养后进行制备，工作量大，且成本较高。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种类芽孢杆菌及其在净化水体方面的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种类芽孢杆菌，经鉴定为类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)，编号YE-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2016年8月4日，保藏编号为CGMCC No.12814。

该菌株具有有效吸附、降解黑臭水体中有机物的功能。

本发明进一步提供了所述类芽孢杆菌YE-1在净化水体中的应用。

第二方面，本发明提供了一种用于净化水体的微生物菌剂，含有所述类芽孢杆菌YE-1。进一步地，所述菌剂中类芽孢杆菌YE-1的数量不小于10⁸个/mL。

第三方面，本发明提供了一种净化水体的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、将待净化水体通入生物氧化反应器；

S2、将所述类芽孢杆菌YE-1富集培养后，接种至生物氧化反应器；

S3、生化反应器以室温运行，通入空气并进行曝气处理，水力停留2～4小时；在这个过程中，类芽孢杆菌会在生化反应器内繁殖生长，并完成水体有机物降解过程；

S4、生物氧化反应器出水进入固液分离反应器，自然沉降完成固液分离后出水，得到净化水体。

进一步地，所述生物氧化反应器内填料为市售硅基多孔填料。

作为优选，S2中，类芽孢杆菌YE-1的添加量相对于待净化水体不小于2×10¹¹～4×10¹¹个/m³。

进一步地，S2中，所述富集培养的方法为将所述类芽孢杆菌YE-1接种入富集培养基中，在25～30℃的培养温度下，100rpm摇床培养至菌液浓度达到10⁸个/mL。

作为优选，所述富集培养基的配方为：0.5g/L酵母浸提物，0.5g/L葡萄糖，0.1g/L氯化钙，0.05g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸氨，1000mL蒸馏水，pH＝7.0。配置时将各成分混合均匀，调pH＝7.0，121℃下灭菌25分钟。

所述富集培养基还可用于分离培养如上所述类芽孢杆菌，作为分离培养基时，在配置时将配方中成分混合均匀后加入30g/L结冷胶，调pH＝7.0，121℃下灭菌25分钟后倒平板。

作为优选，本发明所述方法对COD>40mg/L、总氮>15mg/L、总磷>1mg/L的易缺氧黑臭的水体具有较佳的净化效果。

进一步地，在利用本发明所述类芽孢杆菌YE-1处理高浓度难降解有机污水时，可以向所处理污水中复配生物营养制剂，以满足本发明的菌种的生长需要。

更进一步地.反应器中的曝气设施的电能供应为分布式光伏系统。与分布式光伏连用的曝气系统可以为该菌种提供适宜的生长环境并为该菌种降解有机物供给氧气，上述工艺流程无需额外提供电能，对黑臭水体有机物降解效率高，运营成本低，处理有效且稳定。

本发明所述的类芽孢杆菌YE-1具有对城市黑臭水体适应性强、生物稳定性好等特点。它们不仅可以有效地降低污水的COD，其最大优势是能够在低温(<5℃)条件下对污水进行处理，仍然具有良好的微生物活性。在本发明的一个实施例中，利用该菌种进行生化现场实验，装置运行180天，微生物生长良好，系统出水稳定。

本发明的有益效果在于：

本发明新分离出一种类芽孢杆菌，可有效的吸附降解黑臭水体有机物，净化水质。此外，与分布式光伏连用的曝气系统可以为该菌种提供适宜的生长环境并为该菌种降解有机物供给氧气，上述工艺流程无需额外提供电能，对黑臭水体有机物降解效率高，运营成本低，处理有效且稳定。

附图说明

图1为本发明所述类芽孢杆菌YE-1的扫描电镜照片。

图2为本发明实施例2所述的分布式光伏供电示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

用于分离培养上述类芽孢杆菌的培养基(简称：分离培养基)，配方为：

0.5g/L酵母浸提物，0.5g/L葡萄糖，0.1g/L氯化钙，0.05g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸氨，1000mL蒸馏水，结冷胶30g/L。

配置时将结冷胶以外的成分混合均匀后加入结冷胶，调pH7.0，121℃下灭菌25分钟。按上述比例配置100ml培养基，每20mL倒一块平板。

用于富集培养上述类芽孢杆菌的培养基(简称：富集培养基)，配方为：0.5g/L酵母浸提物，0.5g/L葡萄糖，0.1g/L氯化钙，0.05g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸氨，1000mL蒸馏水。

配置时将各成分混合均匀，调pH7.0，121℃下灭菌25分钟。

实施例1菌株的筛选与鉴定

1、筛选

1)在100mL含所述类芽孢杆菌泥样中加入0.3g酵母粉，在30℃摇床100rpm轻轻震荡富集培养1周，利用显微镜检测判断细菌生长情况；泥样取自广西龙江河。细菌生长至测量细菌培养液在600nm处的吸光值，得到的OD600的数值如果在0.6～0.8之间。

2)采用膜过滤将上述培养液中的细菌过滤，并将细菌用20mL无菌水洗下。以5％的接种量分别接种于多个100mL富集培养基中，45℃度进行培养，并设置不接种对照(CK)。100rpm摇床培养两周后观察细菌生长情况。

3)将富集培养基液梯度稀释1、2、3、4、5(分别对应10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5)，分别取100μL稀释液涂布在分离培养基配制的平板上，45℃培养三天。挑单菌落进行进一步平板划线，分离得到单菌落。挑取单菌落后，转入新的固体培养基平板中，利用平板划线分离法继续进行分离培养，直至获得单菌落。

2、鉴定

通过菌株形态观察和理化指标分析，挑选出12株菌株进行实验室内的黑臭水体处理实验，实验水体为1000mL，处理前水中氨氮为15±2mg/L、总氮为50±2mg/L和COD为300±3mg/L，实验接菌量为2×10⁸个，25℃摇床培养15h，处理后的水质指标如表1。

表1 12株分离菌株处理黑臭水体前后水质参数(单位：mg/L)

从上表可以看出，编号为YE-1的菌株处理污水的综合效果最佳。经YE-1菌株处理15h后，污水中化学需氧量(COD)、总氮(TN)和总磷(P)的去除率分别达到80％、80％和70％，其净化水体的能力最强。

YE-1菌株的菌体细胞呈短杆状，大小为2μm×1μm。革兰氏阳性，产芽孢，芽孢为圆形或椭圆形，中生或近中生，大小为1μm。菌落圆形或近似圆形，表面粗糙扁平，稍有光泽(似蜡烛样颜色)，菌落直径1～2mm(如图1所示)。

用16S rDNA克隆文库技术分析鉴定菌种YE-1。将1mL菌液离心得到菌泥，提取总DNA，利用PCR技术以原核生物通用引物530f和1490r扩增16S rDNA片段。PCR产物纯化后与Promega的T-easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α。挑取的白色菌落通过菌落PCR确定阳性菌落，经酶切分型，对4个克隆测序。所得序列经Blast比较表明，该菌株为Paenibacillus属细菌，命名为Paenibacillus YE-1。

实施例2净化水体

1、将典型黑臭水体(济南腊山河黑臭水体)通入生物氧化反应器，该生物氧化反应器内填充市售硅基多孔填料。

该废水水质如下：pH7.0；化学需氧量(COD)，45mg/L；总氮(TN)，15mg/L，总磷(P)，3mg/L。

2、将经鉴定的类芽孢杆菌的菌种，接种在富集培养基中25℃摇床100rpm培养至菌浓度为10⁸个/mL；然后将菌液(也可称作菌剂，同发明内容中所述菌剂)接种至生物氧化反应器内，接种量为3L/m³。生物氧化反应器底部充空气，曝气量依水质不同而不同，水力停留1小时；

3、曝气设备的电能供应为分布式光伏系统；

4、反应后出水通入固液分离反应器，静置沉淀固液分离后出水；

5、整个反应系统连续运转30天，出水水质分析如下：化学需氧量(COD)去除率70％，总氮(TN)去除率80％，总磷(P)去除率70％。

本发明提供的处理黑臭水体的方法，通过分布式光伏供电提供曝气(如图2所示)，在类芽孢杆菌菌种的吸附降解作用下，黑臭水体可获得有效处理。

实施例3低温下净化水体

1、将典型黑臭水体(济南腊山河黑臭水体)通入生物氧化反应器，该生物氧化反应器内填充市售硅基多孔填料，该废水水质如下：pH7.0；化学需氧量(COD)，45mg/L；总氮(TN)，15mg/L，总磷(P)，3mg/L。

2、将经鉴定的类芽孢杆菌的菌种，接种在富集培养基中，5℃摇床100rpm培养至菌浓度为10⁸个/mL；然后将菌液(也可称作菌剂，同发明内容中所述菌剂)接种至低温环境(<5℃)生物氧化反应器内，接种量为3L/m³。生物氧化反应器底部充空气，曝气量依水质不同而不同，水力停留1小时；

3、曝气设备的电能供应为分布式光伏系统；

4、反应后出水通入固液分离反应器，静置沉淀固液分离后出水；

5、整个反应系统连续运转30天，出水水质分析如下：化学需氧量(COD)去除率67％，总氮(TN)去除率78％，总磷(P)去除率60％。可看出该菌株在低温下依然具有较强的黑臭水体净化能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。