一种利用双醛纤维素脱除多糖提取液中蛋白质的方法与流程

本发明涉及一种多糖分离纯化过程中脱除蛋白质的新方法。特别涉及一种不采用传统的化学或酶法进行脱蛋白，而是利用双醛纤维素与蛋白质反应生成希夫碱进行脱蛋白的方法，属于脱蛋白方法的创新领域。

背景技术：

多糖广泛存在于各种动植物和微生物组织中，由于多种多样的生物活性功能，使其成为天然药物的研究热点。但在多糖溶液中常常含有杂质蛋白质，因此如何有效去除蛋白质成为一个很有意义的研究内容。王珊、黄胜阳在《植物多糖提取液脱蛋白方法的研究进展》中就植物多糖提取液中脱蛋白的方法作了综述，全面介绍了化学法、物理法、生物法和联用法，其中化学法包括Sevage法、三氯乙酸法、盐酸法、鞣酸法、氯化钠法、氯化钙法等，物理法包括反复冻融法、阴离子交换树脂法等，生物法有蛋白酶法、酿酒酵母发酵法等。宋逍、赵鹏等在《穿山龙多糖脱蛋白工艺研究》中研究4种脱蛋白方法对穿山龙多糖脱蛋白的影响，包括Sevage法、三氯乙酸法、盐酸法和酶法，结果确定木瓜蛋白酶结合Sevage法是一种良好的穿山龙多糖脱蛋白方法。罗莹、林勤保等在《大枣多糖脱蛋白方法的研究》中比较了Sevage法、酶法+Sevage法、单蛋白酶法和复合蛋白酶法脱蛋白的效果，证明复合酶法效果最佳。朱思洁、吴天祥等在《灰树花胞外多糖脱蛋白工艺研究》中比较了Sevage法、酶法和三氯乙酸法脱蛋白的效果，结果证明三氯乙酸法可作为灰树花胞外多糖纯化的一种有效的脱蛋方法。高英春、陈钧在《山药粗多糖脱蛋白方法的对比研究》中采用三氯乙酸法、盐酸法、胰蛋白酶法对山药多糖进行脱蛋白研究，结果表明胰蛋白酶法可以有效脱除蛋白并使多糖损失较小。

综合以上文献介绍，Sevage法、三氯乙酸法、盐酸法和酶法为实验室中常用的脱蛋白方法。Sevage法脱蛋白使用的试剂是氯仿和正丁醇，而氯仿是有毒物质，容易造成多糖活性下降和溶剂残留，此方法操作费时、有机溶剂消耗大成本较高、对环境污染较大且对操作人员伤害较大。三氯乙酸法脱蛋白操作时沉淀现象比Sevage法明显，但脱蛋白时易损失较多多糖，而且脱蛋白后多糖的复溶性明显减弱，对多糖结构影响较大，因此该方法脱蛋白的效果较差。盐酸法脱蛋白的效果虽然较好，但若实验条件未严格控制，多糖的损失率较高，且存在多糖水解的缺点。酶法是利用蛋白酶使多糖提取液中的蛋白质在蛋白酶催化下发生水解反应，从而除去蛋白，蛋白酶法专一性强，使其效果不稳定，也有可能破坏蛋白多糖复合物的结构，影响其功效，并且蛋白酶价格昂贵，导致此方法成本较高。

通过检索，公开专利文献：多糖精制中的一种脱蛋白方法(CN1793181A)中脱蛋白方法是将多糖浸提液的温度降至0-5℃，加入有机酸调pH为3.5-4.6，作用1-2小时后离心，取上清液浓缩干燥即得脱蛋白后的多糖。公开专利文献：一种姬松茸粗多糖脱蛋白方法(CN1821274A)中脱蛋白方法是采用至少一种弱酸性阳离子树脂或弱碱性阴离子树脂，将姬松茸粗多糖进行柱层析分离游离蛋白和多糖。公开专利文献：玉米须多糖脱色和脱蛋白工艺的方法(CN101914166A)中脱蛋白方法是将玉米须多糖脱色液在一定条件下加酶，反应完后沸水浴灭酶5min。离心，加Sevage试剂，振荡，离心去沉淀。公开专利文献：一种啤酒花多糖的提取和脱蛋白方法(CN102558379A)中脱蛋白方法是采用木瓜酶-三氯乙酸法联用进行脱蛋白处理。

通过对比，上述公开专利文献与本专利申请在发明目的及技术方案方面有较大不同。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的多糖分离纯化过程中脱除蛋白质的方法，该法是利用双醛纤维素来脱除多糖溶液中蛋白质。双醛纤维素是高碘酸钠选择性地氧化纤维素的C₂和C₃位羟基成醛基而得到，其醛基可以和蛋白质中的氨基、亚氨基反应生成希夫碱，从而达到脱除蛋白的效果。目前未见有利用双醛纤维素脱蛋白的报道。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，包括如下步骤：

(1)按照热水提取、浓缩、醇沉、过滤和干燥的工序制得粗多糖；

(2)将粗多糖移入反应罐中，加入纯净水配制成质量百分数为1％～4％的多糖溶液；

(3)在步骤(2)所得多糖溶液中加入氧化度为0～100％的双醛纤维素，控制料液比(g/mL)范围为1∶200～6∶200，设置反应温度20～60℃，调节pH值为7～11，在特定温度下反应1～8小时，待反应完毕，经冷却、离心分离，得上清液；

(4)取步骤(3)所得上清液移入反应罐，按照步骤(3)的操作重复2～3次，得到脱除蛋白后的多糖溶液。

本发明的优点和积极效果是：

(1)本发明的特征是通过向粗多糖溶液中加入双醛纤维素即可达到脱除蛋白质的目的。相比于传统脱蛋白方法，本方法简单稳定、成本低、易于操作且应用广泛。

(2)本发明在实现粗多糖脱除蛋白过程中采取的原料是纤维素，纤维素是自然界中贮藏量第一的天然有机化合物，具有来源广泛、可再生性、可降解性和价格低廉等优势。

(3)本发明在双醛纤维素脱蛋白的基础上，可以实现氧化剂高碘酸钠的回收利用，能避免Sevage等方法中有机试剂的浪费和残留。不仅提高了粗多糖的脱蛋白率，也有利于原料的综合有效的利用，可谓一举两得。

附图说明

图1双醛纤维素脱蛋白前(a)和脱蛋白后(b)的扫描电镜照片。

图2双醛纤维素脱蛋白前(a)和脱蛋白后(b)的差示扫描量热曲线。

图3双醛纤维素脱蛋白前(a)和脱蛋白后(b)的红外分析谱图。

图4双醛纤维素脱蛋白前(a)和脱蛋白后(b)的X-射线衍射谱图。

图5双醛纤维素(DAC)法和Sevage法对山药多糖的脱蛋白效果。

图6双醛纤维素(DAC)法和Sevage法对黄芪多糖脱蛋白的效果。

图7双醛纤维素(DAC)法和Sevage法对灵芝多糖脱蛋白的效果。

以上所述双醛纤维素均以针叶木为原料制备的双醛纤维素为例。

具体实施方式

下面结合附图详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

以下实验步骤应用于整个实施例中：

(1)双醛纤维素的制备：称取针叶木或阔叶木纤维素粉末，加入高碘酸钠和去离子水，调节pH＝3，水浴30℃避光反应一定时间，得到氧化度为不同的双醛纤维素，干燥，研磨成粉末备用。

(2)按照热水提取、浓缩、醇沉、过滤和干燥的工序制得山药、灵芝、黄芪粗多糖；

(3)三种多糖均采用Sevage法脱蛋白，与双醛纤维素法进行对比。Sevage法：向粗多糖溶液以体积比5∶1加入10mL Sevage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)，震荡20min，离心，除去水层和试剂层交界处的变性蛋白质。此步骤重复7次。

下面结合实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1：

1)将山药粗多糖移入反应罐中，加入纯净水配制成质量分数为1％的多糖溶液，备好以针叶木为原料制备的双醛纤维素待用；

2)在1L山药多糖溶液中加入20g氧化度为78％的双醛纤维素，控制料液比范围为4∶200(g/mL)，调节pH值为8，混匀，40℃恒温反应4小时，待反应完毕，经冷却、离心分离，得上清液；按照上述操作重复3次，得到脱除蛋白后的多糖溶液。以脱蛋白率为指标，与Sevage法进行对比，双醛纤维素法脱蛋白4次后，脱蛋白率达到88.35％；用Sevage法脱蛋白4次后，脱蛋白率达到74.38％。

实施例2：

1)将山药粗多糖移入反应罐中，加入纯净水配制成质量分数为2％的多糖溶液，备好以阔叶木为原料制备的双醛纤维素待用；

2)在1L山药多糖溶液中加入5g氧化度为23％的双醛纤维素，控制料液比范围为1∶200(g/mL)，调节pH值为7，混匀，20℃恒温反应8小时，待反应完毕，经冷却、离心分离，得到脱除蛋白后的多糖溶液。以脱蛋白率为指标，与Sevage法进行对比，双醛纤维素法脱蛋白1次后，脱蛋白率达到49.87％；用Sevage法脱蛋白1次后，脱蛋白率达到47.93％。

实施例3：

1)将山药粗多糖移入反应罐中，加入纯净水配制成质量分数为3％的多糖溶液，备好以针叶木为原料制备的双醛纤维素待用；

2)在1L山药多糖溶液中加入20g氧化度为97％的双醛纤维素，控制料液比范围为6∶200(g/mL)，调节pH值为11，混匀，50℃恒温反应1小时，待反应完毕，经冷却、离心分离，得上清液；按照上述操作重复2次，得到脱除蛋白后的多糖溶液。以脱蛋白率为指标，与Sevage法进行对比，双醛纤维素法脱蛋白3次后，脱蛋白率达到56.32％；用Sevage法脱蛋白3次后，脱蛋白率达到50.53％。

实施例4：

1)将灵芝粗多糖移入反应罐中，加入纯净水配制成质量分数为4％的多糖溶液，备好以阔叶木为原料制备的双醛纤维素待用；

2)在1L灵芝多糖溶液中加入15g氧化度为85％的双醛纤维素，控制料液比范围为3∶200(g/mL)，调节pH值为9，混匀，30℃恒温反应6小时，待反应完毕，经冷却、离心分离，得上清液；按照上述操作重复1次，得到脱除蛋白后的多糖溶液。以脱蛋白率为指标，与Sevage法进行对比，双醛纤维素法脱蛋白2次后，脱蛋白率达到25.90％；用Sevage法脱蛋白2次后，脱蛋白率达到7.02％。

实施例5：

1)将灵芝粗多糖移入反应罐中，加入纯净水配制成质量分数为1％的多糖溶液，备好以阔叶木为原料制备的双醛纤维素待用；

2)在1L灵芝多糖溶液中加入5g氧化度为23％的双醛纤维素，控制料液比范围为1∶200(g/mL)，调节pH值为10，混匀，40℃恒温反应5小时，待反应完毕，经冷却、离心分离，得上清液；按照上述操作重复3次，得到脱除蛋白后的多糖溶液。以脱蛋白率为指标，与Sevage法进行对比，双醛纤维素法脱蛋白4次后，脱蛋白率达到68.56％；用Sevage法脱蛋白4次后，脱蛋白率达到52.04％。实施例6：

1)将灵芝粗多糖移入反应罐中，加入纯净水配制成质量分数为2％的多糖溶液，备好以针叶木为原料制备的双醛纤维素待用；

2)在1L灵芝多糖溶液中加入25g氧化度为78％的双醛纤维素，控制料液比范围为5∶200(g/mL)，调节pH值为8，混匀，60℃恒温反应2小时，待反应完毕，经冷却、离心分离，得上清液；按照上述操作重复2次，得到脱除蛋白后的多糖溶液。以脱蛋白率为指标，与Sevage法进行对比，双醛纤维素法脱蛋白3次后，脱蛋白率达到47.81％；用Sevage法脱蛋白3次后，脱蛋白率达到34.96％。

实施例7：

1)将黄芪粗多糖移入反应罐中，加入纯净水配制成质量分数为4％的多糖溶液，备好以针叶木为原料制备的双醛纤维素待用；

2)在1L黄芪多糖溶液中加入10g氧化度为56％的双醛纤维素，控制料液比范围为2∶200(g/mL)，调节pH值为7，混匀，50℃恒温反应7小时，待反应完毕，经冷却、离心分离，得上清液；按照上述操作重复1次，得到脱除蛋白后的多糖溶液。以脱蛋白率为指标，与Sevage法进行对比，双醛纤维素法脱蛋白2次后，脱蛋白率达到42.69％；用Sevage法脱蛋白4次后，脱蛋白率达到40.76％。

实施例8：

1)将黄芪粗多糖移入反应罐中，加入纯净水配制成质量分数为1％的多糖溶液，备好以阔叶木为原料制备的双醛纤维素待用；

2)在1L黄芪多糖溶液中加入20g氧化度为23％的双醛纤维素，控制料液比范围为4∶200(g/mL)，调节pH值为9，混匀，60℃恒温反应3小时，待反应完毕，经冷却、离心分离，得上清液；按照上述操作重复3次，得到脱除蛋白后的多糖溶液。以脱蛋白率为指标，与Sevage法进行对比，双醛纤维素法脱蛋白4次后，脱蛋白率达到81.32％；用Sevage法脱蛋白4次后，脱蛋白率达到76.23％。

实施例9：

1)将黄芪粗多糖移入反应罐中，加入纯净水配制成质量分数为3％的多糖溶液，备好以针叶木为原料制备的双醛纤维素待用；

2)在1L黄芪多糖溶液中加入30g氧化度为97％的双醛纤维素，控制料液比范围为6∶200(g/mL)，调节pH值为11，混匀，20℃恒温反应2小时，待反应完毕，经冷却、离心分离，得上清液；按照上述操作重复2次，得到脱除蛋白后的多糖溶液。以脱蛋白率为指标，与Sevage法进行对比，双醛纤维素法脱蛋白3次后，脱蛋白率达到80.23％；用Sevage法脱蛋白3次后，脱蛋白率达到75.58％。