一株克百威单克隆抗体杂交瘤细胞株YH1及其应用的制作方法

本发明涉及一株克百威单克隆抗体杂交瘤细胞株YH1及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。

背景技术：

克百威又名呋喃丹，属氨基甲酸酯类杀虫、杀螨、杀线虫剂，1969年由FMC公司和Mobay化学公司开发生产。广泛应用于粮食、蔬菜、水果及经济作物等害虫的防治。按中国农药毒性分级标准，呋喃丹为高毒农药，受呋喃中毒致死的小鸟或其它昆虫，被猛禽类、小型兽类或爬行类动物觅食后，可引起二次中毒而致死。由于克百威的毒性大，在酸性土壤中不易降解，极易污染土壤和地下水源，尤其是在粮食和蔬菜上的大量使用，形成农药残留，对公众健康造成不可估量的危害。

目前检测克百威色谱法应用最为广泛，包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用 (LC-MS)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)等的仪器方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂，成本高，时间长，不能实现大量样品的快速检测，因此建立快速简便的克百威检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有高特异性和检测灵敏度的克百威单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。提供一株抗克百威单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对克百威具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立克百威的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株克百威单克隆抗体杂交瘤细胞株YH1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12029。

抗克百威单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12029的克百威单克隆抗体杂交瘤细胞株YH1分泌产生。

所述抗克百威单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中克百威的分析检测。

本发明提供的YH1细胞株的制备基本步骤为：

1）半抗原的合成：

a)活化酯的合成

将呋喃酚（1.64 g，10 mmol）溶于二氯甲烷（50 mL）中，冰浴下加入三乙胺（1.11 g，11 mmol），搅拌10min后，加入相应的二（对硝基苯）碳酸酯（3.19 g，10.5 mmol），逐渐升温至室温（30℃），搅拌1h，TLC板检测反应完成（Rf = 0.6, 石油醚︰乙酸乙酯 = 10︰1），待用。

b)酯的合成

冰浴下，向上述反应液中加入经三乙胺（2.22g, 22 mmol）碱化的4-氨基丁酸甲酯盐酸盐（1.697 g，10 mmol）二氯甲烷溶液（10 mL），室温搅拌过夜，水洗，饱和盐水洗（各50 mL*2），无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液经真空旋干，柱层析纯化（硅胶（200-300目），流动相：石油醚︰乙酸乙酯 = 15︰1~10︰1 洗脱），得产物1.8 g。

c)产物酸的合成

将中间体酯（1.8 g，5.86 mmol）溶于1,4-二氧六环（1,4-dioxane, 15 mL）中，加入三氟醋酸（TFA, 18 mL）和水（15 mL），60℃加热反应4h，冷至室温，用乙酸乙酯（2*30 mL）萃取，依次进行下述洗涤：水，饱和碳酸氢钠水溶液，水，饱和食盐水（各30 mL*2），无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液经真空旋干，柱层析纯化，硅胶（200-300目），流动相：石油醚︰乙酸乙酯 = 5︰1 洗脱，得产物730mg，即为半抗原CARB；

2）完全抗原CARB-KLH的制备：称取4.5 mg CARB，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐10mg，N-羟基琥珀酰亚胺6mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反应8h。取匙孔血蓝蛋白KLH 3mL(5mg/mL)，加入等体积硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CARB-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

3）小鼠的免疫：完全抗原CARB-KLH与等量QuickAntibody-Mouse5W佐剂(北京博奥龙免疫技术有限公司)混合均匀，通过大腿肌肉注射BALB/c小鼠。首次免疫100μg/只，多次加强免疫50μg/只，每次免疫间隔21天，最后一次用克百威完全抗原CARB-KLH（25μg/只，不含佐剂）冲击免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；

4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得克百威单克隆抗体杂交瘤细胞株YH1；

5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。

本发明的有益效果：本发明提供的细胞株分泌的单克隆抗体，对克百威具有较好的特异性和检测灵敏度IC50 为0.3ng/mL，可实现对水、果蔬、谷物中克百威残留量的检测，为食品中克百威残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：一株克百威单克隆抗体杂交瘤细胞株YH1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12029，保藏日期2016年1月20日，分类命名为单克隆细胞株。

附图说明

图1. YH1分泌的单克隆抗体对克百威的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将克百威完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对克百威有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例 1 克百威单克隆抗体杂交瘤细胞株YH1的制备

（1）半抗原的合成：将呋喃酚（1.64 g，10 mmol）溶于二氯甲烷（50 mL）中，冰浴下加入三乙胺（1.11 g，11 mmol），搅拌10min后，加入相应的二（对硝基苯）碳酸酯（3.19 g，10.5 mmol），逐渐升温至室温（30℃），搅拌1h，TLC板检测反应完成（Rf = 0.6, 石油醚︰乙酸乙酯 = 10︰1），待用。冰浴下，向上述反应液中加入经三乙胺（2.22g, 22 mmol）碱化的4-氨基丁酸甲酯盐酸盐（1.697 g，10 mmol）二氯甲烷溶液（10 mL），室温搅拌过夜，水洗，饱和盐水洗（各50 mL*2），无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液经真空旋干，柱层析纯化（硅胶（200-300目），流动相：石油醚︰乙酸乙酯 = 15︰1~10︰1 洗脱），得产物1.8 g。将中间体酯（1.8 g，5.86 mmol）溶于1,4-二氧六环（1,4-dioxane, 15 mL）中，加入三氟醋酸（TFA, 18 mL）和水（15 mL），60℃加热反应4h，冷至室温，用乙酸乙酯（2*30 mL）萃取，依次进行下述洗涤：水，饱和碳酸氢钠水溶液，水，饱和食盐水（各30 mL*2），无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液经真空旋干，柱层析纯化，硅胶（200-300目），流动相：石油醚︰乙酸乙酯 = 5︰1 洗脱，得产物730mg，即为半抗原CARB。

（2）完全抗原的合成：称取4.5 mg CARB，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐10mg，N-羟基琥珀酰亚胺6mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反应8h。取匙孔血蓝蛋白KLH 3mL(5mg/mL),加入等体积硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CARB-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。

（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的Balb/C小鼠进行免疫。完全抗原CARB-KLH与等量QuickAntibody-Mouse5W佐剂混合均匀，通过大腿肌肉注射BALB/c小鼠。首次免疫100μg/只，多次加强免疫50μg/只，每次免疫间隔21天，第二次免疫后7天采血，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第四次免疫后21天冲击免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

（4）细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0瘤细胞： 融合前7-10天，将 SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。 融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到 1-4×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min。 第1min，将1mL的PEG 1500 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5min。 离心（800rpm，8min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到 96 孔细胞板，置于37℃、5% CO2 培养箱中培养。

（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用克百威为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对克百威标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株YH1。

（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG 型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

6.1包被：将包被原CARB-OVA用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液从1 µg/mL开始倍比稀释，100 μL/孔，37℃反应2 h；

6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3 min；

6.3封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；

6.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，50 μL/孔，37℃反应0.5h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，50 μL/孔，37℃反应0.5h；

6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15 min；

6.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。

用ic-ELISA测定单克隆抗体对克百威的IC50为：0.3 ng/mL，说明抗体对克百威有很好的灵敏度，可用于克百威免疫分析检测。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800 mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000 mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05 % 吐温 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na2HPO4^.12H2O 18.43 g，柠檬酸 9.33 g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

表1. 杂交瘤细胞株YH1单克隆抗体的交叉反应率

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