一种重组解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法和应用与流程

文档序号:17387731发布日期:2019-04-13 00:16阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种重组解脂耶氏酵母工程菌株,其特征在于,所述菌株为琥珀酸脱氢酶编码基因sdh5和乙酰辅酶A水解酶编码基因ach1缺失的解脂耶氏酵母,所述重组解脂耶氏酵母工程菌株积累琥珀酸。

2.根据权利要求1所述的重组解脂耶氏酵母工程菌株,其特征在于,重组解脂耶氏酵母工程菌株以甘油为底物发酵的琥珀酸发酵产量可达10g/L及以上,或者以甘油为底物发酵的琥珀酸发酵产率可达0.26g g-1甘油及以上。

3.根据权利要求2所述的重组解脂耶氏酵母工程菌株,其特征在于,重组解脂耶氏酵母工程菌株以甘油为底物发酵的琥珀酸发酵产量可达12g/L及以上;或者以甘油为底物发酵的琥珀酸发酵产率可达0.28g g-1甘油及以上。

4.根据权利要求1或2所述的重组解脂耶氏酵母工程菌株,其特征在于,所述重组解脂耶氏酵母工程菌株为在初始解脂耶氏酵母菌株基础上通过基因敲除手段敲除琥珀酸脱氢酶编码基因sdh5和乙酰辅酶A水解酶编码基因ach1的积累琥珀酸的解脂耶氏酵母。

5.根据权利要求4所述的重组解脂耶氏酵母工程菌株,其特征在于,初始解脂耶氏酵母为野生型解脂耶氏酵母。

6.根据权利要求4所述的重组解脂耶氏酵母工程菌株,其特征在于,初始解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母菌株Y.lipolytica Po1f菌株。

7.一种权利要求1~6中任一项所述的重组解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法,其特征在于,利用基因敲除的方法使解脂耶氏酵母中琥珀酸脱氢酶复合体与乙酰辅酶A水解酶失去活性;琥珀酸脱氢酶复合体失活为琥珀酸脱氢酶编码基因sdh5敲除,乙酰辅酶A水解酶失活为乙酰辅酶A水解酶编码基因ach1敲除。

8.根据权利要求7所述的构建方法,其特征在于,琥珀酸脱氢酶编码基因sdh5敲除的方法,是利用质粒JMP113提供大小为1.2kb的ylURA3片段,通过PCR扩增获得目的基因sdh5的上下游长同源臂片段,借助Gibson组装获得带有sdh5上下游长同源臂片段和筛选标记ylURA3的重组片断,然后PCR扩增该重组片断,转化ura3缺陷型解脂耶氏酵母,重组片断在酵母自身重组酶的作用下与基因组上的目的基因发生重组,从而将原来的目的基因sdh5替换下来。

9.根据权利要求7所述的构建方法,其特征在于,乙酰辅酶A水解酶编码基因ach1敲除的方法,是利用质粒JMP114提供大小为1.8kb的ylLEU2片段,通过PCR扩增获得目的基因ach1的上下游长同源臂片段,借助Gibson组装获得带有ach1上下游长同源臂片段和筛选标记ylLEU2的重组片断,然后PCR扩增该重组片断,转化解脂耶氏酵母,重组片断在酵母自身重组酶的作用下与基因组上的目的基因发生重组,从而将原来的目的基因ach1替换下来。

10.权利要求1-6任一项所述的重组解脂耶氏酵母工程菌株在发酵制备琥珀酸中的应用。

11.一种发酵制备琥珀酸的方法,其特征在于,采用权利要求1-6任一项所述的重组解脂耶氏酵母工程菌株进行发酵,将活化后的重组解脂耶氏酵母工程菌株转接到发酵培养基中进行发酵培养,制备琥珀酸。

12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述发酵培养基以甘油作为碳源。

13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,发酵培养基组成为:2%蛋白胨,1%酵母粉,2%甘油,其余为水。

14.根据权利要求11或12所述的方法,其特征在于,重组解脂耶氏酵母工程菌株的发酵培养过程为好氧条件发酵。

15.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述好氧条件为:维持发酵摇瓶振荡培养的转速为200r/min及以上,在整个发酵过程中不调节发酵液的pH。

16.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,好氧条件为28℃,220rpm转速摇瓶振 荡培养,不控制pH。

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