一种青蛤抗肿瘤提取物的制作方法

本发明涉及一种海洋生物活性物质，具体涉及一种青蛤抗肿瘤提取物。

背景技术：

前列腺癌的发病率在男性恶性肿瘤中位居首位，好发于老年男性。在我国，前列腺癌发病率呈逐年上升趋势，居泌尿系统肿瘤的首位，严重威胁老年男性的健康。传统治疗方法如手术、放疗和冷冻治疗等效果并不理想，且复发率比较高，并且当复发的前列腺癌转化为非雄激素依赖性时，治疗将更困难；而化疗药物产生耐药性后，疗效更差并毒副作用明显。因此，寻找抗前列腺癌药物成为学者们研究的热点。海洋是发现新型抗癌药物的一个丰富的资源宝库，多种海洋寡肽、糖胺聚糖等都具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌等生理活性。从双壳贝类中提取的文蛤寡肽mere15、菲律宾蛤仔寡肽对人慢性骨髓性白血病k562细胞、前列腺癌细胞具有增殖抑制作用，并导致浓度依赖性细胞凋亡；从近江牡蛎提取的糖胺聚糖具有体内外抗肿瘤活性，不仅可以抑制k562、cne-2z、hela细胞的生长，还对ctx损伤小鼠的免疫功能有一定的修复作用。青蛤（cyclinasinensis）属于软体动物门，鳃瓣纲，异齿亚纲，帘蛤目、帘蛤科，含高蛋白、低脂肪和高含量的不饱和脂肪酸，味道鲜美，具有很好的营养价值。青蛤在民间入药具有悠久的历史，是一种重要的海洋药物，具有软坚散结、清热燥湿及镇咳作用。changxingj等从青蛤中提取出的多糖具有抗氧化和保肝活性，对人胃癌bgc-823细胞的生长具有强烈的抑制作用。然而，目前关于青蛤寡肽的提取及活性的研究报道并不多，本实验采用蛋白酶酶解青蛤内脏，经正交实验获得最佳酶解条件，经分离纯化，筛选出活性寡肽，研究其体外抗人前列腺癌du-145细胞的活性，以期为青蛤活性寡肽的制备及抗癌作用研究提供实验依据。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抗肿瘤功效的青蛤抗肿瘤提取物。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种青蛤抗肿瘤提取物，该提取物的分子结构为：

采用上述成分配制青蛤抗肿瘤提取物的应用制剂，按重量份数含有青蛤抗肿瘤提取物1-5份、灵芝1-3份、黄芪1-5份、茯苓1-10份、丹参10-20份、半支莲1-10份、白花舌蛇草2-10份、葛根3-20份。可预期的能达到一定的抗肿瘤效果。

该青蛤抗肿瘤提取物肽采用如下方式制备：

1）取青蛤匀浆，以活性酶在最适酶解温度及ph值条件下，加蛋白酶200~12000u/g、保温4~10h进行酶解；然后后灭活，在0~4^oc、12000r/min的条件下离心，取上清；

2）取最佳酶种及最优酶解条件下酶解的上清液，用截留分子量为3ku的超滤膜进行超滤；

3）取超滤组分进行琼脂糖凝胶层析分离，浓度：0.01~0.5g/ml，离心后取上清过0.22µm滤膜，进行洗脱；收集洗脱产物，冷冻干燥；

4）取组分过hplc进一步分离得到青蛤抗肿瘤提取物；

青蛤抗肿瘤提取物的分子结构为：

与现有技术相比，本发明提供的青蛤抗肿瘤提取物的优点在于：本发明工艺科学合理，操作简单，随着青蛤抗肿瘤提取物浓度的增加，作用时间的延长，du-145细胞的增殖抑制率明显上升；倒置显微镜下观察、ao/eb荧光染色、hoechst33258荧光染色及透射电镜技术实验表明细胞出现凋亡的形态学变化；流式细胞仪结果表明，细胞早期凋亡率及线粒体膜电位下降所占百分率增加，且随着青蛤抗肿瘤提取物浓度增加，早期凋亡率增加较为明显，其膜电位下降更为显著，即预示线粒体凋亡信号通路在青蛤抗肿瘤提取物诱导的du-145细胞凋亡过程中起着重要作用。同时，本发明所制备的青蛤抗肿瘤提取物是天然原料经酶解制得，安全、无毒副作用，抗肿瘤活性显著，青蛤抗肿瘤提取物可以作为抗癌药品、食品添加剂、功能食品进行开发。

附图说明

图1本为发明实施例分子结构示意图；

图2本为发明实施例琼脂糖凝胶柱洗脱峰示意图；

图3本为发明实施例峰3高效液相色谱图；

图4本为发明实施例峰3组分在280nm处高效液相色谱图；

图5为本发明实施例对du-145细胞的增殖抑制作用示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例：

一种青蛤抗肿瘤提取物，该提取物的分子结构为：

随着青蛤抗肿瘤提取物浓度的增加，作用时间的延长，du-145细胞的增殖抑制率明显上升；倒置显微镜下观察、ao/eb荧光染色、hoechst33258荧光染色及透射电镜技术实验表明细胞出现凋亡的形态学变化；流式细胞仪结果表明，细胞早期凋亡率及线粒体膜电位下降所占百分率增加，且随着青蛤抗肿瘤提取物浓度增加，早期凋亡率增加较为明显，其膜电位下降更为显著，即预示线粒体凋亡信号通路在青蛤抗肿瘤提取物诱导的du-145细胞凋亡过程中起着重要作用。同时，本发明所制备的青蛤抗肿瘤提取物是天然原料经酶解制得，安全、无毒副作用，抗肿瘤活性显著。

一种青蛤抗肿瘤提取物的应用制剂按重量份数含有青蛤抗肿瘤提取物1-5份、灵芝1-3份、黄芪1-5份、茯苓1-10份、丹参10-20份、半支莲1-10份、白花舌蛇草2-10份、葛根3-20份、0.01-0.1份胺氰基硼烷和0.01-0.1份胺羧基硼烷。采用上述组合的制剂尤其是胺氰基硼烷和胺羧基硼烷的使用能使实验结果更好。

青蛤抗肿瘤提取物的制备方法如下：

1）取青蛤匀浆，以活性酶在最适酶解温度及ph值条件下，加蛋白酶200~12000u/g、保温4~10h进行酶解；然后后灭活，在0~4^oc、6000~12000r/min的条件下离心，取上清；

2）取上清液，用截留分子量为3ku的超滤膜进行超滤；

3）取超滤组分进行琼脂糖凝胶层析分离，浓度：0.01~0.5g/ml，离心后取上清过0.22µm滤膜，进行洗脱；收集洗脱产物，冷冻干燥；

4）取组分过hplc进一步分离得到青蛤抗肿瘤提取物。

活性酶为碱性蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶或中性蛋白酶或胃蛋白酶。

步骤3）洗脱的条件为：柱尺寸：10×300-310mm；柱料：琼脂糖；柱料颗粒大小：10±2µm；上样量：500µl；流动相：超纯水；洗脱液流速：0.5ml/min；检测波长：280nm；自动收集体积：3.2ml/管。

步骤4)色谱条件为，色谱柱：填料粒径为5μm4.6×250mm的zorbaxsb-c18分析型色谱柱；检测波长：214nm，280nm；流速：0.8ml/min；流动相a为含0.05%tfa的乙腈，流动相b为含0.06%tfa的超纯水，采用梯度洗脱方式，流动相a与流动相b的流动相体积比为20∶80；柱温：25^oc；自动进样，进样量：500μl；

洗脱方式为：0%-0%b洗脱4min；0%-100%b洗脱25min；100%-100%b洗脱6min。

选取峰3的hplc保留时间约为15min的峰组分进行收集，峰面积38.47，峰高2829.00，即为青蛤提取物的产品，分子量301.34da，命名为目标肽2；同样收集的纯品再次上hplc检测纯度，在280nm处约8min时出现主要单一峰，即纯的青蛤提取物。

实验中样品与试剂

青蛤，购于舟山市菜市场（经浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定）。经洗净、去壳、取内脏，并用0.1mol/l的naoh溶液浸泡去脂，于蒸馏水中轻轻搅拌去杂质，加一倍体积的纯水匀浆后备用。

青蛤寡肽：本实验室自制，分子量为＜3ku；碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，北京亚太恒信生物科技有限公司；f12培养基，gibco公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程公司；mtt、胰蛋白酶，sigma公司；ao/eb（吖啶橙/溴化乙锭），杭州昊天生物技术有限公司；jc-1细胞线粒体膜电位试剂盒，上海贝博生物；nm23h1单克隆抗体为santacruz公司产品，工作浓度为1：100，试剂盒为dako公司产品。其余试剂均为分析纯。

细胞株采用人前列腺癌du-145细胞购于中科院上海细胞所，由本室传代保存。

主要仪器与设备

cf16rxⅱ型高速低温离心机，日本日立公司；forma3111co2培养箱，美国thermo公司；cogentuscale超滤系统，默克密理博；apurifierupc100快速蛋白液相色谱系统，gehealthcare；agilent-1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；超净台，上海智城分析仪器制造有限公司；ckx4倒置显微镜、bx2-flb3荧光显微镜和ccd-nc6051显微摄像，日本olympus公司；酶标仪，美国bio-rad公司；easycyte6ht-2l流式细胞仪，美国millipore公司；hitachih-7650透射电镜，日立公司。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。