基于川芎转录组序列开发的EST‑SSR标记引物组、其获取方法及应用与流程

本发明属于分子标记技术开发及应用的技术领域，更具体地，涉及一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组、其获取方法及应用。

背景技术：

川芎为是伞形科藁本属药用植物，主要种植于四川彭州，都江堰等地，是我国著名传统中药材，以其干燥根茎入药，其味辛，性温，有活血行气、祛风止痛功效，用于治疗头痛、风湿、月经不调等。

川芎有效成分研究十分深入，研究者分离出了包括川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯等多种有效成分。检索川芎研究文献结果显示，对川芎活性成分提取，药理药性上的研究较多。对川芎遗传多样性、种质指纹图谱、基因定位、遗传图谱构建、分子育种等研究却鲜有报道，川芎中能够用于上述研究的分子标记甚少，都是一些通用引物，如RAPD、ISSR、ITS等，使得川芎分子研究难以深入，严重限制了川芎优质种质资源快速、有效的选育及生产应用。

微卫星序列又称简单重复序列（SSR）、短串联重复序列，由若干个串联重复单元组成，每单元含1-10个核苷酸，广泛分布在真核生物基因组中（9-10）。SSR具有标记之间密度大、材料间多态性好、易扩增、重复性高等优点，已被广泛在水稻，玉米，小麦等作物上应用。SSR按来源分为两类genome-SSR和EST-SSR，随着EST数据库的不断丰富，EST-SSR被大量开发。截止目前，药用植物已有红花、丹参、党参、人参、西洋参、金银花等开发了EST-SSR，逐渐代替通用引物应用于遗传多样性、道地性鉴定等研究。

近年来二代测序飞速发展，成本急剧降低。使得利用转录组测序开发EST-SSR成为一种便捷高效的手段。但目前还未有利用川芎转SSR标记引物的报道。因此，利用转录组数据批量开发川芎EST-SSR引物。该标记能直接用于川芎种质资源指纹图谱构建、遗传作图、基因定位和比较基因组学研究，对川芎品种的标准化、真伪品种的鉴定、分子标记辅助选择育种都有重要作用。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组、其获取方法及应用。

本发明提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组，所述引物组包括74对引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148所示。

本发明还提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，该方法包括以下步骤：

（1）对川芎转录组测序数据拼接，拼接去冗余得到unigene；

（2）利用MISA软件对拼接到的unigene进行SSR位点发掘；

（3）利用Primer 3.0软件对上述SSR检测结果进行引物设计，得到设计的EST-SSR引物；

（4）采用CTAB方法提取川芎的基因组DNA，用设计的EST-SSR引物对川芎DNA进行PCR扩增，然后进行毛细管电泳，根据电泳结果数据筛选出EST-SSR标记引物组。

进一步的，步骤（2）中，SSR位点发掘时的基本参数设置为：单核苷酸至少重复10次，双核苷酸至少重复6次，三核苷酸至少重复5次，四核苷酸至少重复5次，五核苷酸至少重复5次，六核苷酸至少重复5次。

进一步的，步骤（3）中，引物设计时参数设置为：引物长度18-25bp；退火温度52.0-60.0℃，且上游引物和下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40%-60%；PCR扩增产物长度100-300bp。

进一步的，步骤（4）中，PCR扩增的反应体系为：DNA2μL、5U·μL^-1Tap酶0.2μL、10mmol·L^-1引物2μL、2.5mmol·L^-1dNTP 2μL、25mM 10×Buffer2μL、ddH₂O 11.8μL。

进一步的，步骤（4）中，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸6min。

本发明基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组在川芎种质资源遗传多样性分析中的应用。

本发明基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组在鉴定川芎品种中的应用。

本发明的有益效果：本发明首次公开了川芎EST-SSR标记引物组，该引物经验证后得到多态性较高的74对EST-SSR，与通用引物相比，川芎EST-SSR标记引物组具有多态性高，易扩增，重复性好，结果更准确等优点，可用于后续川芎的遗传图谱构建、川芎品种指纹图谱构建等基础研究，促进川芎分子育种和功能基因发掘、中药品种标准化等应用研究。

附图说明

图1是本发明开发的EST-SSR标记引物组的UPGMA聚类图谱；

图2是本发明利用引物对25得出的川芎样品扩增产物的毛细管电泳图；

图3是本发明利用引物对43得出的川芎样品扩增产物的毛细管电泳图；

图4是本发明利用引物对52得出的川芎样品扩增产物的毛细管电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。

本发明的一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组，其中，各引物的核苷酸序列如表1（序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148）所示。

一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，该方法包括以下步骤：

（1）拼接川芎转录组测序数据，得到通用基因库(unigene)；

（2）利用MISA软件发掘川芎EST-SSR位点；

（3）利用Primer3进行批量设计SSR引物；

（4）挑选235对引物进行合成，对收集的川芎资源进行扩增、验证；

（5）用NTSYS-pc2.l0e软件对川芎资源进行聚类分析，使用POPGENE对川芎各个引物多样性指数进行检测。

实施例1

本实施例制备川芎EST-SSR标记引物组，包括以下步骤：

(1)川芎转录组数据的SSR引物获得

（1.1）对川芎根转录组测序数据拼接，拼接去冗余得到unigene。

（1.2）利用MISA软件对拼接到的unigene进行SSR位点发掘，基本参数设置为单核苷酸至少重复10次，双核苷酸至少重复6次，三核苷酸至少重复5次，四核苷酸至少重复5次，五核苷酸至少重复5次，六核苷酸至少重复5次。

（1.3）采用Primer 3.0软件对上述SSR检测结果进行引物设计，参数设置为引物长度18-25bp；退火温度52.0-60.0℃，且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40%-60%；PCR扩增产物长度100-300bp。去重复后，得到设计出的引物共计3602个，合成其中的235对。

（2）利用CTAB方法提取川芎的基因组DNA，川芎材料如表2所示。用设计的EST-SSR引物对上述材料的DNA进行PCR扩增，用于验证引物设计的效率，同时筛选出多态性较高的核心引物。

（2.1）取新鲜幼嫩的川芎叶片，采用CTAB提取法提取川芎DNA。

（2.2）PCR扩增：总体积20μL，DNA2μL、Tap酶（5U·μL^-1)0.2μL、引物（10mmol·L^-1）2μL、dNTP(2.5mmol·L^-1)2μL、10×Buffer(25mM)2μL、ddH₂O 11.8μL。扩增反应程序为：预变性94℃5min，34个循环（94℃变性30S，56℃退火30s，72℃延伸30s），72℃延伸10min，降温到20℃，-4℃保存）。

（2.3）PCR产物中加入5μL的dilution buffer，最后一孔加25μL DNALadder，30-1500bp分离胶进行毛细管电泳。

（2.4）利用毛细管电泳自动数据分析软件PROSize^TM分析数据，有条带的数据为“1”，没有条带的为“0”。

（2.5）使用NTSYS-pc2.l0e软件对34份川芎样品进行聚类分析，使用POPGENE软件计算各引物的等位基因数(Na)、基因多样性(h)和Shannon值(I)。

（2.6）利用实施步骤2.1-2.5对235对SSR引物进行检测，发现74对扩增条带清晰、且有多态性的引物。聚类分析结果显示34份川芎遗传相似系数为0.58-0.91，被分成两大类。Nei基因多样性为0.31，Shannon指数为0.46，川芎聚类结果没有明显的地域关系，这与四川川芎种植时相互引种有关。

表1

表2

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所

<120> 基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组、其获取方法及应用

<160> 148

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccaaaaagt attgaatatg acaaa 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcccctggt actcaccatc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agtgtgatgg agatggaggc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcatatgatg gaccgaccaa 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcacttagcc ttgttaaaga cc 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacctcattt ggcttccctt 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcaacaagaa aggttaaata agca 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agatgggttc atggaagtcg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagcacgagc ttttgtcatt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gccagtcccc tttcctctta 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acattttgaa tttcagctgt tgt 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tggcactcac aaaacaccat 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgaaagaata ccatgatgcc a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tggccgtgca atttgtaata 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaaggttgaa gtttctcatt ttg 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaggatttaa tgcaccggaa 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tcaacgaata tgcgtgtttc a 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aaacagcagc agcacaaaaa 20

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttcaacccca gtttactgag tc 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctggtgaaat tgagctgtgc 20

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aacatggaac acacataaca tacaa 25

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tgttttcacc ccgttgtttt 20

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cttgtgaata ccataataca gagca 25

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atggaaatcg atcggtgact 20

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

aggcaagaaa cgactcaaat g 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cagagactgg ttgtggggtt 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

agcagttcag cataccctcc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aaatttacgc agcagggttc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tgggtggaag tcatgaaaga 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

atatacccag ccttttcgca 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tgctatcgac tccagaggaa a 21

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgggcctgag ggagtatta 19

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gcgttctgaa tacagcactt g 21

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

aaattagtgg tcccccgatg 20

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tgacagagct attctttggt tcttt 25

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gggactggca ggactctgta 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

caaatctatt ctcgggcaaa 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gaaagggtga tcgagtccaa 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ggagaattgc aactgtgcat 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

agccaaagtc gtaagaggca 20

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tgtaatatac ctgcttggca aaaa 24

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ggcatgaaac caacttcaaa a 21

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gttctaactt taaggctgga ctaact 26

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

tgcagaggta caattcgtgt g 21

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ccctatcact cagcaacacc 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gccagtcccc tttcctctta 20

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ctccttgttc ccactcagtc t 21

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

agccccatta ctttcccagt 20

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

aggacacagg tggacttcaa a 21

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

aatttgcacc accccataga 20

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tcaacatatc tatggctcat ttcaa 25

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

cacgtgcatc cacacacata 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

tatcgttgaa cccgaacctc 20

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

ggatagtagt gaagggatat gctacag 27

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

cacaatcaaa catagctcca ca 22

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

cgtgttaaat tcgttcgttc c 21

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

accccaaaac atggaagaag 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

acttgcggcc acgtaaatag 20

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

cgagtacaaa tccacagctc a 21

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

gggcctggat agaacagaca 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

aagggaaaat gtgatgcgac 20

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

acatcaaacg attgaaaacc taa 23

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

atcttttcca tccacatggc 20

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

ttgatttgca attattctag ggc 23

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

gcaaagatgg caataccctg 20

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gcaccacgaa gaatagaagc a 21

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

attgtgggta gcaatcagcc 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

aagccttcca agattcagga 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

aacgatgatg atgatggggt 20

<210> 70

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

cagttaaacc tcctcctccc tt 22

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

gatgtccagt ccccttcaaa 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

gcgtgtcaca agtgtggaag 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

gccaccacca acacctaaat 20

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

ggtaaggagg cggtttgatt 20

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

gcaatcaaac aatgccaaaa 20

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

gtgctggaaa acccaagaag 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

acttcgaatg tcggaatcca 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

cgaaatcgtc gaatgaatga 20

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

gcaatggatt aggaccgcta 20

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

ttttcgtcat ttcaccatcg 20

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

gtcgagaagc cgagagagaa 20

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

acccccgaca tttatcgagt 20

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

ccgttctcca aacaccaact 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

gggggaaagaa aatcggaagt 20

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

tgaagccaag aacagtgcaa 20

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

aacaacccag agctgcaaac 20

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

gaagccactc actaatcgcc 20

<210> 88

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

ttaccaggaa gatcaccagg a 21

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

acaaaccaaa cgtcccacat 20

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

ctttcctcta ggcgctttca 20

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

cgtttgacat tttccgaggt 20

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

tcaacgaatt aggattcgcc 20

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

tattatttcc attcccgcca 20

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

cgatcaacgg tgatgatttg 20

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

tcctctttct ttgcctcagc 20

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

tactttccga ggtgaaggga 20

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

cggatcttct tgctattcgg 20

<210> 98

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

gcccaccaag taaagattgc 20

<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

cgcacacaca gacacacaag 20

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

ttgttacttc cacccccaga 20

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

ttgcattgct tctgcatgat 20

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

ggtcaaagaa gccgtagtgg 20

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

tccagattgt gggttgttga 20

<210> 104

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

ctggcacttg tacgaaacca 20

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

gtctgatatt gggcctgctc 20

<210> 106

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 106

atcggcctcc ttatcatcct 20

<210> 107

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 107

ataagttcgt gcaaatcggg 20

<210> 108

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 108

gcagcagcaa gaaatgtacg 20

<210> 109

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

tttgacacca ccaccatcag 20

<210> 110

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 110

ggtcatgctc aagaagttcc a 21

<210> 111

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 111

gttctggtgc aggacaaggt 20

<210> 112

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 112

aggttgtgag gcagatcaaa 20

<210> 113

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 113

atgagttctt catccgtggg 20

<210> 114

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 114

caatcaaatc ttcctccctc t 21

<210> 115

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 115

gcgacactcc tatgccatct 20

<210> 116

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 116

gcaagcctta catgcgttct 20

<210> 117

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 117

tgctaaatcg gcgagtttct 20

<210> 118

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 118

tcatttccat tacacacggc 20

<210> 119

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 119

gtttccgcca gtgaagtagc 20

<210> 120

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 120

caaaacatac aatttccctg gat 23

<210> 121

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 121

atcgagatgg gtggtctcag 20

<210> 122

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 122

ggaaacttga tgtggaaatg ag 22

<210> 123

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 123

cagatctccg tccagggtaa 20

<210> 124

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 124

actgcaatca atgtccacca 20

<210> 125

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 125

cagaatcacc agaacccgta a 21

<210> 126

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 126

ttgctgtgtt tgaaatgttg g 21

<210> 127

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 127

ttgatggaaa acatcctacg g 21

<210> 128

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 128

taagaggtgg cggacagttt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 129

cttctttttg gctgctaccg 20

<210> 130

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 130

aggaacactc ggcctcataa 20

<210> 131

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 131

acatcgacac caaacagcaa 20

<210> 132

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 132

aaggtcgcga aaatgatgac 20

<210> 133

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 133

cttgggtcgg gtcttgttta 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 134

ccactttcaa ttttccccaa 20

<210> 135

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 135

aaaagcaaac atcaatatga ccaa 24

<210> 136

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 136

cagctttagg gactcatcgg 20

<210> 137

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 137

gcatagtgaa gaagagccgc 20

<210> 138

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 138

caacccgaac taaaatctcc a 21

<210> 139

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 139

caaacaattc cacaagaacc aa 22

<210> 140

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 140

ttgctgcccc tactactgct 20

<210> 141

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 141

tgtcaatatg tgtttggggg 20

<210> 142

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 142

tcacctgcca cttagttttc c 21

<210> 143

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 143

agtaccacca cctccaccag 20

<210> 144

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 144

agcacatggt cctaactggg 20

<210> 145

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 145

ctggttgacc tggatgacct 20

<210> 146

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 146

tgatcaattc gaggagggtc 20

<210> 147

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 147

agagtgagcg acatcggagt 20

<210> 148

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 148

ccctcagctc ttccctttct 20