转基因玉米品系VCO‑01981‑5检测方法和试剂与流程

本申请涉及转基因玉米检测领域，特别是涉及一种转基因玉米品系VCO-01981-5定量检测方法和试剂。
背景技术：
：转基因农作物自1996年商业化种植以来，全球转基因作物种植面积迅猛发展。截止2013年全球转基因作物种植面积已达到约1.75亿公顷，比2012年增长3％。按照种植面积统计，全球约81％的大豆、35％的玉米、30％的油菜和81％的棉花都是转基因产品。转基因作物种植面积排在前6位的国家是美国、巴西、阿根廷、加拿大、印度和中国。伴随转基因作物高速发展的同时，转基因作物的食品安全问题也一直是多年来讨论的热点，并直接影响到国际贸易和公众对转基因产品的接受程度。目前关注的焦点已从“是否是转基因”转移到“含有哪些转基因成分及各自的含量”，为满足公众知情权、管理水平和检测技术能力的需求，许多国家纷纷出台了转基因限量规定，如欧盟规定转基因作物的成分超过0.9％，必须进行标识；而日本的现行标准为5％。我国目前的标准最为严格，对转基因产品实行“零容忍”，只要在产品中检出转基因成分就需要进行标识。考虑到转基因低水平混杂等客观实际，目前这一“零容忍”政策在技术执法角度来讲过于苛刻，因此，从我国各口岸转基因检测水平的实际出发，为国家政策部门提出合理的转基因阈值迫在眉睫；首当其冲的便是开发转基因成分的精准定量检测方法。转基因玉米VCO-01981-5是最新的耐草甘膦除草剂新品系，由总部设在巴黎的公司GenectiveS.A..(GroupLIMAGRAIN与GroupKWS的合资企业)开发，并于2013和2014年分别在美国和加拿大获准商业化生产和利用。该品系未获我国农业部批准，国际、国内也无相应的品系特异性定性或定量检测方法。因此，亟需研究一种有效的转基因玉米VCO-01981-5检测方法。技术实现要素：本申请的目的是提供一种转基因玉米品系VCO-01981-5检测方法和试剂。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请公开了一种转基因玉米品系VCO-01981-5的检测方法，包括在PCR反应体系中加入矿物油，混匀后，将其转移到微滴发生器上，自动产生微滴，然后将微滴全部转移到反应管中进行PCR反应，PCR反应结束后，读取每个微滴的扩增信号，并采用QuantaSoftV1.3.2软件计算待测样品的靶标DNA分子数；PCR反应体系为双重实时荧光PCR扩增体系，包括PCR反应液、品系VCO-01981-5特异引物组、品系VCO-01981-5特异探针、HMG基因特异引物组、HMG基因特异探针和待测样品的DNA；品系VCO-01981-5特异引物组的正向引物为SeqIDNo.1所示序列，品系VCO-01981-5特异引物组的反向引物为SeqIDNo.2所示序列，品系VCO-01981-5特异探针为SeqIDNo.3所示序列，HMG基因特异引物组的正向引物为SeqIDNo.4所示序列，HMG基因特异引物组的反向引物为SeqIDNo.5所示序列，HMG基因特异探针为SeqIDNo.6所示序列；SeqIDNo.1：5’-aaggccttcagtctactcctcggg-3’SeqIDNo.2：5’-ctagcggccgctactcgagggattt-3’SeqIDNo.3：5’-cgtcaccaagaagatcagtactcaaacac-3’SeqIDNo.4：5’-TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3’SeqIDNo.5：5’-GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3’SeqIDNo.6：5’-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-3’其中，SeqIDNo.3所示序列的品系VCO-01981-5特异探针中，5’末端具有FAM荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团；SeqIDNo.6所示序列的HMG基因特异探针中，5’末端具有HEX荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团。需要说明的是，本申请的转基因玉米品系VCO-01981-5的定量检测方法，实际上就是微滴式数字PCR。其原理是，在一个PCR反应管中油水反应体系被微滴发生器制备成近20000个油包水小微滴，当待测DNA模板分子数低于一定的数目，微滴只含有一个分子的DNA模板和足够量的用于荧光PCR反应所需的所有其它组分如dNTP、TaqDNA聚合酶以及探针和引物等。待所有微滴实时荧光PCR反应结束后，逐一检查每个微滴，只要微滴有荧光信号检出，就被认为有实时荧光PCR反应发生，记有一个分子的待测模板被检出，统计所有阳性微滴数，就可得出样品中待测DNA模板的分子数。本申请采用双通道法，即分别对玉米品系VCO-01981-5特异性探针，以及玉米内源基因特异性探针，采用不同的荧光标记，在同一个PCR反应体系中同时测定内源基因和品系特异序列的分子数。其中，本申请检测的内源基因HMG在玉米基因组中仅一个拷贝，并且玉米品系VCO-01981-5特异性序列也仅有一个拷贝；因此，通过计算样品中品系特异性序列和HMG序列分子数的比值就可计算得出转基因玉米品系VCO-01981-5的绝对含量。因此，本申请的检测方法中，还包括，采用QuantaSoftV1.3.2软件分别计算出转基因玉米品系VCO-01981-5的分子数和HMG基因分子数后，根据转基因玉米品系VCO-01981-5分子数和HMG基因分子数的比值，计算转基因玉米品系VCO-01981-5的绝对含量。本申请的另一面公开了一种转基因玉米品系VCO-01981-5定量检测的试剂，该试剂包括第一引物探针组合和第二引物探针组合，所述第一引物探针组合用于品系VCO-01981-5特异性检测，所述第二引物探针组合用于HMG基因特异性检测；第一引物探针组合中，正向引物为SeqIDNo.1所示序列，反向引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列，并且探针的5’末端具有FAM荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团；第二引物探针组合中，正向引物为SeqIDNo.4所示序列，反向引物为SeqIDNo.5所示序列，探针为SeqIDNo.6所示序列，并且探针的5’末端具有HEX荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团。需要说明的是，本申请的试剂，实际上就是转基因玉米品系VCO-01981-5的定量检测方法中所采用的品系VCO-01981-5特异性检测引物探针，和HMG基因特异性检测引物和探针。可以理解，本申请的引物和探针是针对微滴式数字PCR而设计的，当然可以单独制备成相应的品系VCO-01981-5检测试剂使用。本申请的另一面公开了本申请的试剂在制备转基因玉米检测试剂盒或检测设备中的应用。本申请的再一面公开了一种转基因玉米检测试剂盒，该试剂盒中含有本申请的试剂。优选的，本申请的试剂盒采用本申请的定量检测方法对转基因玉米品系VCO-01981-5进行定量检测。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：本申请的转基因玉米品系VCO-01981-5的检测方法，设计了配套使用的内源基因HMG特异性引物探针和品系VCO-01981-5特异性引物探针，两者配套使用，采用双通道法，分别定量出两者在玉米基因组中的分子数，最终计算出转基因玉米品系VCO-01981-5的绝对含量。本申请的定量检测方法，不同于常规的实时荧光PCR的相对定量，能够对待检样品中转基因玉米品系VCO-01981-5成分进行精准定量，对转基因成分的研究和我国口岸转基因检测具有重要意义。附图说明图1是本申请实施例中特异性检测FAM通道的输出结果图；图2是本申请实施例中特异性检测HEX通道的输出结果图；图3是本申请实施例中稳定性试验FAM通道的输出结果图；图4是本申请实施例中稳定性试验HEX通道的输出结果图；图5是本申请实施例中梯度稀释检测的HEX通道数据的拟合标准曲线图；图6是本申请实施例中梯度稀释检测的FAM通道数据的拟合标准曲线图。具体实施方式转基因玉米品系VCO-01981-5，是近些年新研发的转基因玉米品系，目前尚没有相应的定性或定量检测方法。因此，本申请率先研究并提出了一种转基因玉米品系VCO-01981-5的检测方法，本申请的检测方法不仅可以定性检测品系VCO-01981-5，而且可以对其进行准确的绝对定量。本申请的检测方法与现有的转基因玉米品系检测中常规使用的一般PCR、实时荧光PCR、PCR-DHPLC等方法不同；一般PCR只能定性检测，实时荧光PCR虽然可以通过对梯度稀释的标准品进行检测，建立标准曲线，通过标准曲线进行相对定量；但是也无法做到绝对定量检测。随着转基因农作物越来越普遍，我国本着转基因“零容忍”的政策，现有的相对定量的检测方法已经不能满足我国口岸转基因检测的使用需求。因此，本申请利用先进的数字PCR检测技术，率先研究并提出了转基因玉米品系VCO-01981-5的定量检测方法。并且，在本申请的定量检测方法中，同时设计了内源基因和品系基因两套配套使用的引物探针，通过双重数字PCR扩增，用两个荧光通道分别统计分析内源基因HMG和品系VCO-01981-5特异性序列的分子数，根据转基因玉米品系VCO-01981-5分子数和HMG基因分子数的比值，计算转基因玉米品系VCO-01981-5的绝对含量。下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例和附图仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。实施例一、材料和方法1.供试材料本例分别采用了转基因玉米品系VCO-01981-5、MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604和ES3272的DNA样品进行试验。以上DNA样品均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供和保藏。2.引物和探针设计本例分别根据玉米内源基因HMG，和转基因玉米品系VCO-01981-5特异性序列设计了特异性检测引物和探针，两条探针分别进行不同的荧光基团标记。引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成与修饰。本例设计的引物和探针序列详见表1。表1内源基因和品系VCO-01981-5特异性引物和探针名称序列(5’-3’)SeqIDNo.VCO-01981-5-Faaggccttcagtctactcctcggg1VCO-01981-5-Rctagcggccgctactcgagggattt2VCO-01981-5-Pcgtcaccaagaagatcagtactcaaacac3HMG-FTTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA4HMG-RGCTACATAGGGAGCCTTGTCCT5HMG-PCAATCCACACAAACGCACGCGTA6其中，VCO-01981-5-P探针5’末端进行FAM荧光基团，3’末端进行BHQ-1淬灭基团；HMG-P探针5’末端进行HEX荧光基团，3’末端进行BHQ-1淬灭基团。3.双重数字PCR反应体系和条件本例的PCR反应体系总计20μL，包括：2×ddPCRSuperMix10μL、3.6μmol/L的玉米品系特异性探针VCO-01981-5-P1μL、6μmol/L的玉米品系正向引物VCO-01981-5-F1μL、6μmol/L的玉米品系反向引物VCO-01981-5-R1μL、3.6μmol/L的内源基因探针HMG-P1μL、6μmol/L内源基因正向引物HMG-F1μL、6μmol/L内源基因反向引物HMG-R1μL、约15ng/μL的DNA模板2μL，补充ddH2O至20μL。配制好20μL的反应液后，将其与70μL的矿物油混匀，转移到微滴发生器上自动产生微滴；将产生的微滴仔细全部转移到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板在封膜仪上封膜，并置于普通PCR仪上进行PCR反应。反应条件为：95℃预变性10min；然后进入40个循环：95℃变性15s、55.7℃退火1min；循环结束后98℃10min使酶热失活。扩增结束。扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中读取信号，并使用QuantaSoftV1.3.2软件分析实验数据。具体的，打开微滴荧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板直接插入荧光检测仪中，设备自动检测每PCR反应管中所有微滴的荧光情况，即PCR反应情况，最后软件根据珀松分布定律直接给出待测DNA序列分子数。本例具体的，根据FAM荧光通道可以得到转基因玉米品系VCO-01981-5的分子数，根据HEX荧光通道可以得到内源基因HMG的分子数。根据品系VCO-01981-5分子数与内源基因HMG分子数的比值可以计算出转基因玉米品系VCO-01981-5的绝对含量。4.质量控制每批(次)定量检测实验需设置对照，对照的设置应符合GB/T19495.2-2004中的规定。每PCR反应管微滴数不少于12000个；加入玉米基因组的分子数不高于微滴数的5倍，每个玉米基因组DNA分子约2.5pg，因此，加入玉米基因组的量不高于12000×5×2.5＝150000pg，即150ng。非转基因样品核酸提取对照、PCR空白对照和阴性对照理论检测结果应为零。但考虑到数字PCR的超灵敏性，特别是非转基因样品核酸提取对照的检查结果为零有时难以实现，因而允许有极少量阳性微滴数出现，但阳性微滴数应低于1/4000，基于经验，12000个微滴不能多于三个阳性微滴，有效阳性检测结果至少是对照阳性微滴数的三倍，即至少9个阳性微滴。二次提取DNA样品的测试结果，其转基因成分含量的相对相差应小于或等于25％。其中，a为第一次提取DNA样品的检测结果；b为第二次提取DNA样品的检测结果；m为a和b的平均数。对同一批次提取的DNA样品，其三次重复PCR测试结果的偏差应小于或等于15％。以上质控条件中有一项不符合者，试验结果应放弃，并应从制备测试样品开始重做实验。5.特异性检测本例以转基因玉米品系VCO-01981-5的DNA样品为阳性样品，以转基因玉米品系MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604和ES3272的DNA样品为阴性样品，并设置一个水空白对照，进行特异性检测。6.稳定性试验本例采用转基因玉米品系VCO-01981-5的DNA样品，将其稀释至20ng/μL的工作浓度，采用本例的双重数字PCR反应体系和条件，设置3个重复反应，对其进行检测，并设置一个转基因玉米品系MIR162的DNA样品作为阴性对照，设置一个水空白对照。本例的DNA样品上样量为50ng，其余与“3.双重数字PCR反应体系和条件”相同。7.检测线性范围试验本例的线性范围是指数字PCR检测体系可以进行转基因成分绝对定量检测的范围。由于本例是基于数字PCR的绝对定量检测，所以确定检测方法的线性范围对界定检测方法的适用范围具有重要意义。本例将转基因玉米品系VCO-01981-5的DNA样品进行7个梯度稀释，分别将其稀释至25ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.04ng/μL、0.008ng/μL和0.0016ng/μL，以2μL上样量，按照本例的“3.双重数字PCR反应体系和条件”进行检测，每个浓度设置3个重复试验，并设置一个品系MIR162的DNA样品作为阴性对照，设置一个水空白对照。8.玉米VCO-01981-5数字PCR的定量检测限和检测限验证在本例的检测方法中，定量检测限(LimitOfQuantitation,LOQ)和检测限(LimitOfDetection,LOD)分别被定义为可以进行稳定定量检测或者检测的最低拷贝数。取“7.检测线性范围试验”的检测下限梯度稀释DNA样品进行LOQ的验证。具体的，将该DNA样品进行十个重复的数字PCR验证，计算每个重复试验的单位体积的内源基因HMG和品系VCO-01981-5特异性序列的拷贝数，计算平均值和RSD值。同样的，取“7.检测线性范围试验”的检测下限梯度稀释DNA样品进行LOD的验证。具体的，将该DNA样品进行10个重复的数字PCR验证，计算每个重复试验的单位体积的内源基因HMG和品系VCO-01981-5特异性序列的拷贝数及其平均值。9.玉米VCO-01981-5数字PCR的精密度实验精密度是指在重复性的条件下，用相同的方法，相同的测试项目，在同一实验室，由同一人员在很短的时间间隔内，使用相同的仪器设备得到的检测结果的标准差。本例具体，采用外源基因LOQ临界值和LOQ临界值10倍浓度的DNA样品进行精密度验证，每个样品做6个重复，计算每个重复试验的单位体积的内源基因HMG和品系VCO-01981-5特异性序列的拷贝数，计算平均值和RSD值。10.玉米VCO-01981-5数字PCR的准确度实验准确度的定义为检测结果与该组公定值之间的相符程度。本例的实验取LOQ值、LOQ5倍、LOQ值25倍的3组阳性DNA样品进行准确度的验证。对以上3组DNA样品进行三个重复的数字PCR实验。计算品系VCO-01981-5特异性序列拷贝数与内源基因HMG拷贝数的比值，将测定的比值与理论比值进行比较，计算其偏差，分析检测方法的准确度。二、结果及分析1.特异性检测结果特异性检测结果如图1和图2所示，其中，图1为FAM通道检测到的荧光信号，即品系特异探针VCO-01981-5-P的扩增信号；图2为HEX通道检测到的荧光信号，即内源基因特异探针HMG-P的扩增信号；图1和图2中，反应孔A01-B02分别为转基因玉米品系MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604和ES3272的检测结果，反应孔E02为VCO-01981-5的检测结果。结果显示，本例的检测方法中，FAM通道的11个转基因玉米品系，仅品系VCO-01981-5有扩增信号，其它10个转基因玉米品系阴性样品均没有扩增信号。而HEX通道中，11个转基因玉米品系都有扩增信号。以上结果说明品系VCO-01981-5引物和探针特异性结果良好。2.稳定性试验浓度20ng/μL的品系VCO-01981-5的DNA样品，其3个重复反应的稳定性检测热点图如图3和图4所示，实验结果的数据分析如表2所示。图3是FAM通道的结果图，图4是通道HEX的结果图，根据反应所得热点图，图3所示，数字PCR所获得的阴性点与阳性点之间有明显的荧光信号差距，拖尾现象不严重，可以通过设置统一的阈值限进行阴性反应点和阳性反应点的区分。该步反应最终结果如表2所示，内源基因探针的三个重复反应的实际检测拷贝数分别为13160、13500和137200，平均检测拷贝数为13460，相对标准偏差(RelativeStandardDeviation,缩写RSD)为2.09％，处于可接受的范围内；外源基因三个重复反应的实际检测拷贝数分别为4660、4480和4740，平均检测拷贝数为4626，RSD为2.87％，处于可接受的范围内。因此，本例的内源基因和外源基因的引物探针扩增稳定性良好，并且该阳性样品稳定可用。需要说明的是，RSD小于等于10％均属于可接受范围，而本例远小于该数值。表2品系VCO-01981-5稳定性检测结果表2中，检测通道FAM为品系VCO-01981-5特异性探针的检测结果，检测通道HEX为内源基因HMG特异性探针的检测结果。3.检测线性范围试验本例的7个梯度稀释25ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.04ng/μL、0.008ng/μL和0.0016ng/μL，在上样量为2μL的情况下，分别对应19002、3800、760、152、30、6、1.2个拷贝的玉米基因组DNA。将以上梯度稀释组的DNA模板进行数字PCR检测，每个浓度梯度组设置3个平行，实验检测结果如表3所示，线性范围内的数据拟合标准曲线如图5和图6所示。图5是DNA样品用量与所测品系特异序列拷贝数之间的关系图，发现在DNA样品用量50ng-0.08ng范围内本例方法测定品系特异序列的拷贝数与DNA样品用量呈高度正相关，相关系数达0.99以上，其拟合曲线方程为y＝4.673x-0.6313,表明本例方法品系特异序列的定量线性范围在4.8-4666.6拷贝之间，跨越了三个数量级。图6是DNA样品用量与所测内源基因拷贝数之间的关系图，发现内参基因拷贝数在3.8-13646.6区间与DNA样品用量呈现出良好的线性关系，相关系数0.99以上，其拟合曲线方程为y＝13.669x-2.3115，表明本例方法内源基因序列的定量线性范围在3.8-13646.6拷贝之间，跨越了四个数量级。以上研究结果表明本例建立的数字PCR方法定量范围广，定量精度高，结果重复性好。表3品系VCO-01981-5数字PCR的线性范围验证结果4.玉米VCO-01981-5数字PCR的定量检测限和检测限验证结果本例具体采用0.08ng的DNA样品上样量进行LOQ的验证，采用0.016ng的DNA样品上样量进行LOD验证。表4品系VCO-01981-5数字PCR的LOQ验证结果表5品系VCO-01981-5数字PCR的LOD验证结果LOQ的验证的DNA样品进行十个重复的数字PCR检测结果见表4，结果显示，该DNA样品的10个平行的检测结果RSD为24％，符合小于25％的要求，说明本例检测方法可以对单位体积外源基因拷贝数为5的样品进行稳定的定量检测。LOD的验证的DNA样品进行十个重复的数字PCR检测结果见表5，结果显示，十个平行中，内源基因阳性检出率为10个，符合LOD质控的不低于9个的要求，说明本例方法可以对单位体积内源基因拷贝数为4的样品进行稳定检测。5.玉米VCO-01981-5数字PCR的精密度实验结果本例分别采用0.08ng和0.8ng的DNA样品上样量进行6个重复试验。检测结果如表6所示，可见，综合分析LOQ临界点和临界点10倍的DNA样品的检测结果，两组浓度的DNA样品所得到的组内RSD值分别为22.78％和10.29％，符合整个检测方法对于精密度的要求，即要求RSD小于25％。表6品系VCO-01981-5数字PCR的精密度结果6.玉米VCO-01981-5数字PCR的准确度实验结果本例分别采用0.016ng、0.08ng和0.4ng的DNA样品上样量进行三个重复试验，试验结果如表7所示。表7玉米VCO-01981-5数字PCR准确度实验结果结果显示，对于上样量0.016ng、0.08ng和0.4ng的DNA标准样品，所测得拷贝数百分比的平均值分别问50％、56.6％和50％，DNA标准样品理论拷贝数百分比为50％，计算得到的检测偏差分别为0.00％，13.20％和0.00％，三组偏差均符合小于25％的要求。因此本方法可以比较准确的对BVLA430101品系进行绝对定量检测。以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。SEQUENCELISTING<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心<120>转基因玉米品系VCO-01981-5检测方法和试剂<130>16I22568<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1aaggccttcagtctactcctcggg24<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>2ctagcggccgctactcgagggattt25<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3cgtcaccaagaagatcagtactcaaacac29<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4ttggactagaaatctcgtgctga23<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5gctacatagggagccttgtcct22<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6caatccacacaaacgcacgcgta23当前第1页1 2 3