ppe25的功能及其用途的制作方法

本发明属于遗传学及生物技术领域，具体涉及ppe25的功能及其用途。

背景技术：

结核病是由结核分枝杆菌复合群引起的一种以呼吸系统感染为主的慢性传染病。目前全球约有1/3的人感染结核分枝杆菌，绝大多数是以潜伏感染的形式存在。现在唯一得到官方认可的用于防治结核病的卡介苗(BCG)，对儿童肺结核起到了保护效果，但对于成人的保护效果不尽如人意。

1998年结核分枝杆菌基因组测序完成，发现了两大富含甘氨酸的蛋白家族PE和PPE，其编码基因大约占整个结核分枝杆菌基因组的10％，PE/PPE蛋白的得名是由于其氨基端分别含有Pro-Glu(PE)和Pro-Pro-Glu(PPE)的基序。目前该基因家族只在致病性分枝杆菌基因组内存在，这更引起了研究者对此研究的兴趣。

ppe25基因存在于结核分枝杆菌EXS-5分泌系统中，包含在ppe25、pe18、ppe26、ppe27、pe19基因簇(简写为ppe25-pe19)中。Sayes等将结核分枝杆菌H37Rv野生株、H37Rv△ppe25-pe19缺失株和H37Rvppe25-pe19::esx-5回复株感染C57BL/6小鼠，感染后测定脾脏和肺的带菌量，感染的第24天和28天H37Rv△ppe25-pe19感染组没有分离到细菌，而野生株组和回复株组中，每只小鼠肺脏分离到的细菌数量均达到10⁸CFU，脾脏分离到的细菌数量达到10⁶CFU，并呈现增长趋势。以上结果表明，ppe25-pe19是结核分枝杆菌的致病因子。但关于这5个蛋白的具体功能研究还未见报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供ppe25的功能及其用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了ppe25用于制备免疫逃逸促进剂的用途。

其一，所述免疫逃逸促进剂能够提高分枝杆菌的免疫逃逸能力。

进一步地，所述免疫逃逸促进剂能够提高分枝杆菌对巨噬细胞的免疫逃逸能力。

更进一步地，所述免疫逃逸促进剂能够提高分枝杆菌在巨噬细胞中的存活能力。所述免疫逃逸促进剂能够提高分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡和坏死的能力。

其二，所述免疫逃逸促进剂还能够增强分枝杆菌应对不良环境的能力。

进一步地，所述免疫逃逸促进剂能够增强分枝杆菌对SDS的耐受能力。

进一步地，所述免疫逃逸促进剂能够增强分枝杆菌在饥饿环境下的生长能力。

本发明对于分枝杆菌的具体类型没有特别的限制。本发明的实施例中，所述分枝杆菌选自耻垢分枝杆菌。

优选地，所述免疫逃逸促进剂包括：ppe25基因。所述ppe25基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

更优选地，所述免疫逃逸促进剂包括：含有ppe25基因的表达载体。

本发明的实施例中，所述表达载体选用穿梭质粒pMV261。

本发明的第二方面，提供一种免疫逃逸促进剂，所述免疫逃逸促进剂包括：含有ppe25基因的表达载体。

本发明的实施例中，所述表达载体选用穿梭质粒pMV261。

本发明的第三方面，提供一种提高分枝杆菌的免疫逃逸能力的方法，包括：将前述免疫逃逸促进剂转化至分枝杆菌中。

本发明对于分枝杆菌的具体类型没有特别的限制。本发明的实施例中，所述分枝杆菌选自耻垢分枝杆菌。

本发明的第四方面，提供一种重组分枝杆菌，所述重组分枝杆菌中转化有含有ppe25基因的表达载体，所述重组分枝杆菌能够表达ppe25蛋白。

进一步地，所述分枝杆菌选自耻垢分枝杆菌。更进一步地，所述结核分枝杆菌选自耻垢分枝杆菌mc²155国际标准株。

进一步地，所述表达载体选用穿梭质粒pMV261。

本发明的第五方面，提供了前述重组分枝杆菌用于制备诱导巨噬细胞凋亡和/或坏死的诱导剂中的用途。

本发明的第六方面，还提供了包括以下任一项或多项的ppe25的用途：

(1)ppe25用于制备能够提高分枝杆菌在巨噬细胞中的存活能力的促进剂的用途；

(2)ppe25用于制备能够提高分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡和坏死的能力的促进剂的用途；

(3)ppe25用于制备能够增强分枝杆菌对SDS的耐受能力的促进剂的用途；

(4)ppe25用于制备能够增强分枝杆菌在饥饿环境下的生长能力的促进剂的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现了ppe25用于制备免疫逃逸促进剂的新用途，为结核病的预防和治疗作出贡献并奠定了重要基础。

附图说明

图1：ppe25基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳，M1：λ-EcoT14 digest DNA Marker；M2：DL2000 DNA marker；1：ppe25-flag-1。

图2：ppe25基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳，M1：λ-EcoT14 digest DNA Marker；M2：DL2000 DNA marker；2：ppe25-flag。

图3：双酶切电泳图，M1：λ-EcoT14 digest DNA Marker；M2：DL2000 DNA marker；1：Enzyme digestion product of pMV261-ppe25-flag。

图4：PCR扩增电泳图，M1：λ-EcoT14 digest DNA Marker；M2：DL2000 DNA marker；3：pMV261-ppe25-flag。

图5：PPE25蛋白免疫印迹，M：Protein marker；1：M.S.(pMV261)；2：M.S.(pMV261-ppe25-flag)。

图6：重组耻垢分枝杆菌的生长曲线。

图7A：在SDS压力条件下PPE25对耻垢分枝杆菌的影响。

图7B：在SDS压力条件下PPE25对耻垢分枝杆菌的影响。

图8：在饥饿条件下PPE25对耻垢分枝杆菌的影响。

图9：体外酸性条件下PPE25对耻垢分枝杆菌的影响。

图10：M.S.(pMV261-ppe25-flag)表达的PPE25蛋白在重组耻垢分枝杆菌的定位分析，M：Protein marker；Supernatant：Bacterial culture supernatant；wall：cell wall；mem：plasma membrane；cyt：cytoplasm；control：M.S.(pMV261)。

图11：重组耻垢分枝杆菌感染RAW264.7细胞后胞内细菌CFU变化。

图12A：重组耻垢分枝杆菌感染RAW264.7细胞后24h引起的凋亡率。

图12B：重组耻垢分枝杆菌感染RAW264.7细胞后24h引起的坏死率。

图12C：重组耻垢分枝杆菌感染RAW264.7细胞后48h引起的凋亡率。

图12D：重组耻垢分枝杆菌感染RAW264.7细胞后48h引起的坏死率。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 表达ppe25基因重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

1材料与方法

1.1菌株、质粒和宿主菌

穿梭质粒pMV261由中国科学院上海巴斯德研究所张晓明研究员馈赠，结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA由中国疾病预防与控制中心传染病预防控制所万康林研究员馈赠，大肠杆菌DH5α菌株和耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis mc² 155菌株和M.S.(pMV261)菌株本实验室保存。

1.2主要试剂

质粒DNA抽提试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒和DNA回收试剂盒购自天根生物科技有限公司；卡那霉素、T4DNA连接酶、 GXL DNA聚合酶、限制性核酸内切酶EcoR I和BamH I、DL2000 DNA Marker、λ-EcoT14 digest DNA Marker、胶回收试剂盒等购自宝生物工程(大连)有限公司；超级感受态细菌制备试剂盒购自碧云天；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、兔抗FLAG抗体购自Sigma公司；Middlebrook 7H10 Agar、OADC、ADC、Middlebrook 7H9 Broth等购自BD公司；硝酸纤维素膜购自Pall公司；TA Cloning试剂盒购于Invitrogen公司；West Pico Cheniluminescent Substrate试剂盒购自Thermo公司；其余常规试剂为国产分析纯。

1.3主要仪器

GelDoc 2000凝胶成像系统、PCR仪、蛋白质电泳仪购自BIO-RAD公司；台式冷冻离心机5804R和2510型电转化仪、台式冷冻离心机Centrifuge 5810R、台式小型离心机MiniSpin和Biophotometer分光光度计购自Eppendorf公司；台式冷冻离心机FRESCO 21购自Thermo公司；恒温水浴锅购自德国Julabo公司；MILli-Q低热原型纯水仪购自法国MILlipore公司；高速冷冻离心机CR 21G购自日本Himac公司；凝胶快速处理系统购自Pyxis公司；超敏多功能成像仪购自Amersham公司。

1.4方法

1.4.1引物的设计和合成

根据Genolist公布的ppe25基因序列，利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，ppe25基因上游引物F：

5’-CTGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGACTTCGGGGCGTTACC-3’(SEQ ID NO.1，划线部分为BamH I酶切位点)。

为了在目的基因下游添加flag标签，设计了两条下游引物，

R1：5’–GTCGTCCTTGTAGTCTCCGGCCGATGGCGGGCGGG-3’(SEQ ID NO.2)，

R：5’-CGGAATTCTAGAGTCGCGGCCGCTCTACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTC-3’(SEQ ID NO.3，划线部分为EcoR I酶切位点)。

1.4.2H37Rv基因DNA的提取

将灭活的结核分枝杆菌H37Rv菌体(湿重80mg)置于1.5mL指形管，加入180μL缓冲液(配方为20mM Tris，pH8.0；2mM Na₂-EDTA；1.2％Triton；终浓度为50mg/mL的溶菌酶，溶菌酶须用溶菌酶干粉溶于缓冲液中，否则会导致溶菌酶无活性)，37℃水浴处理过夜。之后按照根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，提取基因组DNA。

1.4.3目的基因的扩增

以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组为模板，利用PCR扩增ppe25，并在其末端添加flag标签。PCR反应体系为： GXL PCR buffer 10μL，dNTPs Mixture 4μL(2.5mM)，DNA模板2μL，引物F和R1各2μL， GXL DNA聚合酶1μL，加超纯水至50μL。PCR反应条件：95℃变性10min；98℃10s，55℃20s，68℃40s，共30个循环；68℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证大小正确，结果如图1所示，通过第一步PCR获得了与预期相符合1098bp和1053bp的特异性条带，紫外灯下切下含目的片段的胶块。

具体操作按照天根琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒进行回收PCR产物。此PCR产物为ppe25-flag-1，以此为模板继续PCR。PCR反应体系为： GXL PCR buffer 10μL，dNTPs Mixture 4μL(2.5mM)，DNA模板5μL，引物F和R各2μL， GXL DNA聚合酶1μL，加超纯水至50μL。PCR反应条件同前，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证大小正确后进行胶回收。如图2所示，获得了1174bp和1129bp大小的特异性条带，与预期的目的基因大小一致。

1.4.4克隆载体的构建与鉴定

将回收纯化的DNA片段与pCR2.1载体连接，首先进行加A处理，体系为：rTaq 2.5μL，dATP 2.5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，回收的目的基因片段17.5μL。混合物金属浴72℃，30min。加A后的目的片段与pCR2.1载体连接，连接体系为：10×T4 DNA ligase Buffer 2μL，加A产物14μL，pCR2.1 vector 2μL，T4 DNA ligase 2μL，混匀后，于16℃金属浴中连接过夜。

制备超级感受态细菌：挑取DH5α LB无抗平板上的单菌落，接种于3mL无抗LB液体培养基中，37℃，180rpm/min摇床培养过夜，吸取100μL菌液于50mL LB液体培养基中进行扩大培养，37℃，200rpm/min摇床培养约2.5～3.5h至对数生长期，即OD600达到0.6-0.7时，将培养的菌液置于冰中，冰浴15min后，4℃，4000g离心5min，弃上清，收集细菌。之后按照超级感受态制备试剂盒说明书操作。最后将感受态置于冰上进行分装，100μL/管，-70℃保存。

转化：DH5α超级感受态置于冰上缓慢融化，将过夜连接产物20μL加入到100μL感受态中，混匀细菌和质粒或连接产物，冰浴放置30min后，于42℃水浴中热休克2min，迅速取出置于冰中，冰浴5min，加入900μL 37℃预热LB无抗液体培养基，混匀后，37℃，200rpm/min，摇床培养1h，2000-3000g离心1min，去除约900μL LB培养液，吸取30μL X-gal(20mg/mL)及4μL IPTG(400mM)与菌液混匀共同涂布含Kan(50μg/mL)的LB平板37℃培养18h。

挑取平板上的阳性单菌落接种至含Kan(50μg/mL)的LB培养基中，37℃，180rpm，扩大培养约16h，室温12000rpm/min，2min，收集细菌，按照质粒DNA提取试剂盒操作说明进行提取。

将提取的质粒进行双酶切，酶切体系:10×K buffer 1μL，BamH I 0.5μL，EcoR I 0.5μL，质粒5μL，SW 3μL，37℃，水浴3h。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证大小正确后，将筛选的阳性克隆送公司测序，使用BLAST软件分析测序结果，保存序列正确的阳性克隆。将鉴定正确的重组质粒命名为pCR2.1-ppe25-flag。根据测序结果，获知正确的ppe25基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

ttggacttcggggcgttaccgccggagatcaattcgggccgtatgtattgcggtccggggtcggggccgatgctggctgcggccgcggcctgggacggggtggccgtggagttggggttggctgcgaccggttatgcgtcggtgatagccgagctgaccggtgcgccgtgggtgggtgcggcgtcgttgtcgatggtggcggcggccacgccgtatgtggcctggctgagccaagccgcggcgcgggccgagcaggcggggatgcaggccgcggcggccgcggcggcttatgaggccgcttttgtgatgacggtgccgccgccggtgattacggcgaatcgggttttggtgatgacgctgattgcgaccaattttttcggtcagaactcggcggcgatcgcggtcgctgaggcgcagtacgccgaaatgtgggcgcaagacgccgttgctatgtatggctatgcggctgcgtcggcgagcgcgtcgcggttgattccgttcgcggcgccgccgaagaccaccaactccgctggggtggtcgcacaggtggctgcggtcgcggcgatgcctggactgctgcaacgactttcgtcggctgcatcggtcagctggtcgaatcccaatgattggtggctcgtgcggttgctgggctcgattacccccacggaaaggacgacgatcgttcgtttgctcggtcagtcgtacttcgcgacgggcatggcgcagttcttcgcctcgatcgcacagcagctgaccttcggcccagggggcacaacggctggctccggcggagcctggtacccaacgccgcaattcgccggcctgggtgcaagccgggcggtgtcggcgagtttggcgcgggccaacaagattggggctctgtcggttccgccgagctgggtcaaaacgactgcactgaccgaaagcccggtcgcccacgcggtgagcgccaaccctaccgtcggttcgtcacacggaccgcatggcctgctccgcggactgccgctagggtcgcggatcactcggcgtagcggcgcctttgcccaccgatatgggttccgtcacagtgtggttgcccgcccgccatcggccggataa。

1.4.5重组表达载体的构建及鉴定

将质粒pCR2.1-ppe25-flag用BamH I和EcoR I双酶切，酶切体系：10×K buffer 2μL，BamH I 1μL，EcoR I 1μL，质粒10μL，SW 6μL，37℃，水浴3h。然后与经同样酶切处理的pMV261载体进行连接，16℃连接过夜，转化至E.coli DH5α，转化步骤参考上文所述，经PCR、酶切和测序鉴定，得到重组质粒pMV261-ppe25-flag。结核分枝杆菌ppe25基因被分别克隆至穿梭质粒pMV261上，双酶切重组质粒产物经1％琼脂糖凝胶电泳如图3所示，可见两条特异性片段，载体为4800bp左右，目的片段为1174bp和1129bp，与预期大小相一致。

1.4.6重组菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)构建与鉴定

耻垢分枝杆菌mc² 155株菌划线于7H10固体培养基(含10％OADC，0.05％Tween 80)上培养，倒置于37℃恒温培养箱中培养3d。挑取单菌落接种于3mL无抗7H9液体培养基(含10％ADC，0.05％Tween 80)中，37℃，200rpm/min剧烈振荡培养2d，以1:100的接种量接种到50mL无抗7H9液体培养基中，37℃，200rpm/min剧烈振荡培养过夜，至OD600为0.6左右。收集菌液在冰上孵育1.5h后，4℃，5000rpm/min，离心10min收集菌体，弃去培养液。用20mL预冷无菌的10％甘油重悬后，4℃，5000rpm/min，离心10min，收集菌体，弃去上清。重复三次，最后加入1mL预冷的10％甘油重悬菌体，以100μL/管分装，保存于-70℃或立即使用。

将M.S感受态细胞于冰上融化，将10μL重组质粒加入到100μL的感受态细胞中，混匀，冰浴10min，转入预冷的干燥无菌的电转杯中，擦去电转杯上的水，置入电转仪电击。电击参数是：电压2.5kV。电击后，立即加入1mL预热的无抗7H9培养基，混匀，并转移至1.5mL的指型管中，37℃，200rpm/min摇床培养3h复苏后，全部平涂于7H10平板(含50μg/mL Kan)，37℃恒温培养箱培养3d。

挑取电击转化后生长出的单菌落，接种于5mL 7H9培养基(含50μg/mL Kan)中，37℃，200rpm/min振荡培养约2d，4℃，12000rpm/min离心2min收集菌体，去离子水洗涤后加入200μL去离子水，沸水煮10min，离心，取上清作为模板进行PCR鉴定。PCR体系参见上文。如图4所示，在1174bp和1129bp处出现特异性条带。将鉴定正确的重组耻垢菌命名为M.S.(pMV261-ppe25-flag)。

实施例2 PPE25蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达及Western blotting鉴定

挑取实施例1中鉴定正确的重组耻垢单菌落接种于3mL 7H9无抗液体培养基中，37℃，200rpm/min剧烈振荡培养2d，到菌生长旺盛期，以1:100的接种量接种到20mL 7H9培养基中，37℃，200rpm剧烈振荡培养过夜，至OD600为0.6左右，45℃热诱导30min后，4℃，5000rpm/min离心10min，收集菌体，弃去培养液，并用PBS离心洗涤三次后用2mL PBS重悬菌体，于冰浴中超声波裂解。

将细菌裂解液进行SDS-PAGE电泳，利用转印仪将蛋白条带转印至硝酸纤维素膜上，加入封闭缓冲液(含5％脱脂奶的TBST缓冲液，TBST缓冲液为15mM NaC1，10mM Tris-HC1，Ph 8.0，0.05％Tween-20混合溶液)，4℃条件下封闭过夜，用封闭液1:5000稀释的兔抗FLAG多抗为一抗，室温孵育6h，用10mL TBST洗膜10min，重复5次。用TBST 1:5000稀释的HRP-羊抗兔IgG为二抗，室温孵育1.5h，TBST洗膜10min，重复5次，用West Pico Cheniluminescent Substrate处理后，使用化学发光显色仪拍照。结果如图5所示，PPE25在相对分子质量为39.51kD处可见明显的条带与预期结果一致，而含空质粒耻垢分枝杆菌培养物无特异的免疫条带出现，说明表达蛋白成功表达。

此外，将蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致。

获知所表达的ppe25蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

LDFGALPPEINSGRMYCGPGSGPMLAAAAAWDGVAVELGLAATGYASVIAELTGAPWVGAASLSMVAAATPYVAWLSQAAARAEQAGMQAAAAAAAYEAAFVMTVPPPVITANRVLVMTLIATNFFGQNSAAIAVAEAQYAEMWAQDAVAMYGYAAASASASRLIPFAAPPKTTNSAGVVAQVAAVAAMPGLLQRLSSAASVSWSNPNDWWLVRLLGSITPTERTTIVRLLGQSYFATGMAQFFASIAQQLTFGPGGTTAGSGGAWYPTPQFAGLGASRAVSASLARANKIGALSVPPSWVKTTALTESPVAHAVSANPTVGSSHGPHGLLRGLPLGSRITRRSGAFAHRYGFRHSVVARPPSAG。

实施例3 表达ppe25基因重组耻垢分枝杆菌生化特性的研究

1材料与方法

1.1菌株

M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)见实施例2构建。

1.2细胞株

小鼠巨噬细胞RAW264.7本实验室保存。

1.3主要试剂

卡那霉素、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、兔抗FLAG抗体购自Sigma公司；Middlebrook 7H10 Agar、OADC、ADC、Middlebrook 7H9 Broth等购自BD公司；硝酸纤维素膜购自Pall公司；West Pico Cheniluminescent Substrate试剂盒购于Thermo；DMEM，胎牛血清购自Hyclone；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自Miltenyi Biotec公司；其余常规试剂为国产分析纯。

1.4主要仪器

蛋白质电泳仪购自BIO-RAD公司；流式细胞仪FACS Aria购自BD公司；台式冷冻离心机5804R和2510型电转化仪、台式冷冻离心机Centrifuge 5810R、台式小型离心机MiniSpin和Biophotometer分光光度计购自Eppendorf公司；台式冷冻离心机FRESCO 21购自Thermo公司；恒温水浴锅购自德国Julabo公司；MILli-Q低热原型纯水仪购自法国MILlipore公司；高速冷冻离心机CR 21G购自日本Himac公司；凝胶快速处理主机购自Pyxis公司；超敏多功能成像仪购自Amersham公司；超速离心机购自BECKMAN COULTER公司。

1.5方法

1.5.1重组耻垢分枝杆菌的培养及生长曲线的检测

挑取7H10固体培养基(含卡那霉素50μg/mL)上的单菌落，转入7H9液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)中，37℃，200rpm/min剧烈振荡培养约72h，调节细菌浓度，加入到新的7H9培养液(含卡那霉素50μg/mL)中使得细菌初始OD600值为0.05，37℃，200rpm/min振荡培养，在培养不同时间取菌液测定其OD600值。如图6所示，由M.S.(pMV261-ppe25-flag)、M.S.和M.S.(pMV261)在7H9液体培养基中的生长曲线可见，两株重组菌的增殖特性无明显差异，约在12h左右进入对数生长期，36h达平台期。表明携带结核分枝杆菌外源基因ppe25的重组耻垢分枝杆菌在营养丰富、培养条件适宜的环境中生长并未受到影响。

1.5.2重组耻垢分枝杆菌对SDS(十二烷基磺酸钠)耐受的影响

挑取7H10固体培养基(含卡那霉素50μg/mL)上M.S.(pMV261-ppe25-flag)、M.S.(pMV261)的单菌落，转入7H9液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)中，37℃，200rpm/min振荡培养约72h至对数(OD600＝0.8-1.0)。

M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261)菌液浓度调成基本一致，取7H9液体培养基至试管中，分别加入M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261)菌液，再加入SDS使其终浓度为0.05％，使最后总体积为5mL，检测细菌初始OD600＝0.05，之后分别在2h、4h、6h，经过SDS短时间处理取相应菌液进行稀释，并凃布7H10平板检测菌落数。在12h、24h、48h，经过SDS长时间处理取相应菌液进行稀释，并凃布7H10平板检测M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261)的菌落形成单位(CFU)，与初始值相比较，计算对应的存活率，统计分析结果。结果如图7A所示，ppe25基因在经过SDS短时间处理时增强了耻垢分枝杆菌对SDS的耐受性。如图7B所示，在SDS长时间处理后，ppe25基因仍能够增强耻垢分枝杆菌对SDS的耐受。

1.5.3重组耻垢分枝杆菌对饥饿环境的影响

挑取7H10固体培养基(含卡那霉素50μg/mL)上M.S.(pMV261-ppe25-flag)、M.S.(pMV261-ppe27-flag)和M.S.(pMV261)的单菌落，转入7H9液体培养基(含卡那霉素50μg/ml)中，37℃，200rpm/min振荡培养约72h至对数(OD600＝0.8-1.0)。将M.S.(pMV261-ppe25-flag)、M.S.(pMV261-ppe27-flag)和M.S.(pMV261)菌液浓度调成基本一致，分别加入到等量PBS液体中进行培养，检测重组菌在营养物质缺乏的压力环境下的生长情况。37℃，200rpm/min震荡培养细菌，在0h，24h，48h，72h，分别收集细菌，涂板计数，与初始值相比较，计算对应的存活率。结果如图8所示，ppe25基因能够增强了耻垢分枝杆菌在饥饿下的生长能力。

1.5.4重组耻垢分枝杆菌对酸性压力的影响

挑取7H10固体培养基(含卡那霉素50μg/mL)M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261)的单菌落，转入7H9液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)中，37℃，200rpm/min振荡培养约72h至对数(OD600＝0.8-1.0)。将M.S.(pMV261-ppe25-flag)、和M.S.(pMV261)菌液浓度调成基本一致，分别加入到等量7H9液体培养基(PH＝4.0)中进行培养，检测重组菌在酸性压力环境下的生长情况。37℃，200rpm/min震荡培养细菌，在0h，24h，48h，72h，分别收集细菌，涂板计数，与初始值相比较，计算对应的存活率。结果如图9所示，随着处理时间的增长各组存活的细菌数均有所下降。但M.S.(pMV261-ppe25-flag)耐酸能力低于M.S.(pMV261)组。

1.5.5重组蛋白在耻垢分枝杆菌中的亚细胞定位分析

重组菌在7H9液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)培养至对数期(OD600＝0.8-1.0)，以1:100比例接种于50ml 7H9培养液(含卡那霉素50μg/ml)中，37℃，200rpm/min剧烈振荡培养约48h，45℃，30min诱导目的蛋白表达。10000rpm/min，离心10min收集菌体和培养上清，PBS洗涤细菌3次，使用4mL PBS重悬菌体。经过超声破碎细胞，4℃，3000g离心5min，收集上清。使用超速离心机，4℃，27,000g离心40min，得到细胞壁成分，将上清转至一新的超高速离心管内。4℃，100,000g离心2h，吸出上清，此为细胞质，沉淀就是细胞膜组分。将各组分进行SDS-PAGE电泳，利用转印仪将蛋白条带转印至硝酸纤维素膜上，加入封闭缓冲液(含5％脱脂奶的TBST缓冲液，TBST缓冲液为15mM NaC1，10mM Tris-HC1，Ph 8.0，0.05％Tween-20混合溶液)，4℃条件下封闭过夜，用封闭液1：5000稀释的兔抗flag多抗为一抗，室温孵育6h，用10mL TBST洗膜10min，重复5次。用TBST 1:5000稀释的HRP-羊抗兔IgG为二抗，室温孵育1.5h，TBST洗膜10min，重复5次，用West Pico Cheniluminescent Substrate处理后，使用化学发光显色仪拍照。结果如图10所示，PPE25蛋白主要定位在细胞壁上，同时在细胞膜组分中也检测到有部分PPE25蛋白的存在。

1.5.6重组耻垢分枝杆菌感染巨噬细胞

1.5.6.1细胞和细菌的培养

小鼠巨噬细胞系RAW264.7培养在高糖DMEM培养基中(含胎牛血清100mL/L)，5％CO₂培养箱，37℃培养。M.S.(pMV261-ppe25-flag)、和M.S.(pMV261)培养在7H9液体培养基中(含卡那霉素50μg/ml)，37℃，200rpm/min振荡培养。

1.5.6.2分枝杆菌感染RAW264.7

M.S.(pMV261-ppe25-flag)、和M.S.(pMV261)培养至对数生长期后，取菌液，CFU计数，计算菌液浓度。取生长状态良好的RAW264.7，用高糖DMEM培养基(含胎牛血清100mL/L)调整细胞浓度至4×10⁵个/mL，接种入24孔板，每孔1mL。取对数生长期细菌，用无菌PBS调整细菌浓度至4×10⁷个/mL，MOI(细菌：细胞)：10:1感染细胞，每孔100μL细菌，5％CO₂培养箱，37℃培养3h后，无菌PBS洗涤细胞3次，清除胞外细菌后每孔加入1ml DMEM完全培养基(含庆大霉素20μl/ml)继续培养，此时开始计时为感染0h。

1.5.6.3重组耻垢分枝杆菌在巨噬细胞的存活率

分别于感染0.5h，2h，4h，6h，20h后，加入1mL含0.2％TritonX-100的PBS裂解细胞7min，之后吹匀，取细胞裂解液稀释恰当倍数，涂布7H10平板(含OADC 100mL/L)，CFU计数，计算活菌量。

结果如图11所示，在感染4h和6h后M.S.(pMV261-ppe25-flag)胞内存活数高于M.S.(pMV261)组，有统计学差异(p＜0.05)，在感染20h后，M.S.(pMV261-ppe25-flag)胞内存活数高于M.S.(pMV261)组，差异有统计学差异(p＜0.05)。表明M.S.(pMV261-ppe25-flag)在巨噬细胞内的存活能力高于M.S.(pMV261)。

1.5.6.4巨噬细胞的凋亡和坏死水平

分别于感染24h和48h后，使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒标记细胞。方法为：

①收获细胞并用预冷的PBS洗涤3次，1200rpm/min，4℃，离心5min；

②弃上清，每10⁶细胞加入1mL 1×Binding Buffer清洗细胞2次，300g，离心10min，收集细胞；

③每10⁶细胞加入100μL 1×Binding Buffer溶液以重悬细胞；

④每10⁶细胞加入10μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15min；

⑤弃上清，每10⁶细胞加入1mL 1×Binding Buffer清洗细胞2次，300g，离心10min。收集细胞；

⑥每10⁶细胞加入500μL 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞。加入5μL PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5min，立即进行流式细胞仪检测。

重组耻垢分枝杆菌感染RAW264.7细胞24h后，M.S.(pMV261-ppe25-flag)组引起的凋亡率明显高于对照组M.S.(pMV261)(p<0.05)(图12A)；感染24h后M.S.(pMV261-ppe25-flag)组引起的坏死率高于对照组M.S.(pMV261)，且M.S.(pMV261-ppe25-flag)组相对M.S.(pMV261)有显著性差异(p<0.05)(图12B)；重组耻垢分枝杆菌感染RAW264.7细胞后48h M.S.(pMV261-ppe25-flag)组引起的凋亡率和坏死率明显高于对照组M.S.(pMV261)(p<0.01)(图12C和图12D)。上述结果表明，M.S.(pMV261-ppe25-flag)诱导细胞凋亡和坏死的能力均高于M.S.(pMV261)，但主要以诱导细胞凋亡为主，且随着感染时间的增长，诱导巨噬细胞凋亡率和坏死率与对照组相比差异增大。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> ppe25的功能及其用途

<130> PCNS

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ppe25基因上游引物F

<400> 1

ctggatcccc gggtaccggt cgccaccatg gacttcgggg cgttacc 47

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R1

<400> 2

gtcgtccttg tagtctccgg ccgatggcgg gcggg 35

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R

<400> 3

cggaattcta gagtcgcggc cgctctactt gtcgtcgtcg tccttgtagt c 51

<210> 4

<211> 1098

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ppe25基因的核苷酸序列

<400> 4

ttggacttcg gggcgttacc gccggagatc aattcgggcc gtatgtattg cggtccgggg 60

tcggggccga tgctggctgc ggccgcggcc tgggacgggg tggccgtgga gttggggttg 120

gctgcgaccg gttatgcgtc ggtgatagcc gagctgaccg gtgcgccgtg ggtgggtgcg 180

gcgtcgttgt cgatggtggc ggcggccacg ccgtatgtgg cctggctgag ccaagccgcg 240

gcgcgggccg agcaggcggg gatgcaggcc gcggcggccg cggcggctta tgaggccgct 300

tttgtgatga cggtgccgcc gccggtgatt acggcgaatc gggttttggt gatgacgctg 360

attgcgacca attttttcgg tcagaactcg gcggcgatcg cggtcgctga ggcgcagtac 420

gccgaaatgt gggcgcaaga cgccgttgct atgtatggct atgcggctgc gtcggcgagc 480

gcgtcgcggt tgattccgtt cgcggcgccg ccgaagacca ccaactccgc tggggtggtc 540

gcacaggtgg ctgcggtcgc ggcgatgcct ggactgctgc aacgactttc gtcggctgca 600

tcggtcagct ggtcgaatcc caatgattgg tggctcgtgc ggttgctggg ctcgattacc 660

cccacggaaa ggacgacgat cgttcgtttg ctcggtcagt cgtacttcgc gacgggcatg 720

gcgcagttct tcgcctcgat cgcacagcag ctgaccttcg gcccaggggg cacaacggct 780

ggctccggcg gagcctggta cccaacgccg caattcgccg gcctgggtgc aagccgggcg 840

gtgtcggcga gtttggcgcg ggccaacaag attggggctc tgtcggttcc gccgagctgg 900

gtcaaaacga ctgcactgac cgaaagcccg gtcgcccacg cggtgagcgc caaccctacc 960

gtcggttcgt cacacggacc gcatggcctg ctccgcggac tgccgctagg gtcgcggatc 1020

actcggcgta gcggcgcctt tgcccaccga tatgggttcc gtcacagtgt ggttgcccgc 1080

ccgccatcgg ccggataa 1098

<210> 5

<211> 365

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> ppe25蛋白的氨基酸序列

<400> 5

Leu Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Gly Arg Met Tyr

1 5 10 15

Cys Gly Pro Gly Ser Gly Pro Met Leu Ala Ala Ala Ala Ala Trp Asp

20 25 30

Gly Val Ala Val Glu Leu Gly Leu Ala Ala Thr Gly Tyr Ala Ser Val

35 40 45

Ile Ala Glu Leu Thr Gly Ala Pro Trp Val Gly Ala Ala Ser Leu Ser

50 55 60

Met Val Ala Ala Ala Thr Pro Tyr Val Ala Trp Leu Ser Gln Ala Ala

65 70 75 80

Ala Arg Ala Glu Gln Ala Gly Met Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

85 90 95

Tyr Glu Ala Ala Phe Val Met Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Thr Ala

100 105 110

Asn Arg Val Leu Val Met Thr Leu Ile Ala Thr Asn Phe Phe Gly Gln

115 120 125

Asn Ser Ala Ala Ile Ala Val Ala Glu Ala Gln Tyr Ala Glu Met Trp

130 135 140

Ala Gln Asp Ala Val Ala Met Tyr Gly Tyr Ala Ala Ala Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ala Ser Arg Leu Ile Pro Phe Ala Ala Pro Pro Lys Thr Thr Asn Ser

165 170 175

Ala Gly Val Val Ala Gln Val Ala Ala Val Ala Ala Met Pro Gly Leu

180 185 190

Leu Gln Arg Leu Ser Ser Ala Ala Ser Val Ser Trp Ser Asn Pro Asn

195 200 205

Asp Trp Trp Leu Val Arg Leu Leu Gly Ser Ile Thr Pro Thr Glu Arg

210 215 220

Thr Thr Ile Val Arg Leu Leu Gly Gln Ser Tyr Phe Ala Thr Gly Met

225 230 235 240

Ala Gln Phe Phe Ala Ser Ile Ala Gln Gln Leu Thr Phe Gly Pro Gly

245 250 255

Gly Thr Thr Ala Gly Ser Gly Gly Ala Trp Tyr Pro Thr Pro Gln Phe

260 265 270

Ala Gly Leu Gly Ala Ser Arg Ala Val Ser Ala Ser Leu Ala Arg Ala

275 280 285

Asn Lys Ile Gly Ala Leu Ser Val Pro Pro Ser Trp Val Lys Thr Thr

290 295 300

Ala Leu Thr Glu Ser Pro Val Ala His Ala Val Ser Ala Asn Pro Thr

305 310 315 320

Val Gly Ser Ser His Gly Pro His Gly Leu Leu Arg Gly Leu Pro Leu

325 330 335

Gly Ser Arg Ile Thr Arg Arg Ser Gly Ala Phe Ala His Arg Tyr Gly

340 345 350

Phe Arg His Ser Val Val Ala Arg Pro Pro Ser Ala Gly

355 360 365