与加系杜洛克猪日增重相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，涉及影响加系杜洛克日增重性状的SNP位点及其在种猪遗传改良中的应用。

背景技术：

杜洛克原产于美国东部的新泽西州和纽约州等地，主要亲本用纽约州的杜洛克和新泽西州的泽西红杂交育成，原称杜洛克泽西，后统称杜洛克，分为美系和加系杜洛克；产于我国台湾的杜洛克经过培育自成风格，因而称台湾杜洛克或台系杜洛克。

由于杜洛克猪适应性好，无应激敏感现象，易饲养管理成功，具有增重快，饲料报酬高(料肉比为2.8～3.2∶1)，胴体品质好、瘦肉率高等优点，广泛适合于工厂化养猪和农户饲养。

猪的日增重是一个重要的经济性状。日增重与猪出栏时间正相关，越高的日增重代表更快的出栏速度。在常规选育中针对日增重的选育主要是在出生阶段、24日龄、30kg、60kg、100kg阶段称重，然后挑选出日增重高的个体。但这个工作费时费力，因此开发一种快速，简单，高效的分子选育方法，在生产中有很大的必要，将加快加系杜洛克日增重的遗传进展。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种与杜洛克日增重性状相关的SNP标记，所述SNP标记的序列位于猪13号染色体，ASGA0056780，该位点上的碱基为G或A。

所述的SNP位点在杜洛克选择育种中的应用。

所述的SNP位点在鉴定杜洛克日增重中的应用。

本发明的另一目的在于提供用于检测前述的与杜洛克日增重性状相关的SNP标记的序列，包括：

引物序列

正向引物 AATAAGACACTGTTCTGAGGATGTAACAC

反向引物 TCATGGATCTGTGCGCTAAAGA

探针 ATGGAGAAAGGGCATAC。

本发明优点如下：

本发明发现了一个影响杜洛克日增重的SNP位点，本发明提供的SNP标记不受杜洛克年龄、性别的影响，可用于杜洛克的日增重早期育种选择，促进育种过程。

附图说明

图1为83头杜洛克表性质分布图；注：X轴代表表型值分布，Y轴代表密度分布，

ADGEBV：日增重估计育种值；Density:频率分布。

图2为加系杜洛克日增重全基因组关联分析；

X轴为染色体名称，Y轴为-logP值，Chromosome：染色体名称

图3为ASGA0056780基因型与表型的对应值；

X轴代表基因型，Y轴代表日增重型值，Genotype：基因型，Phenotype：表型

具体实施方式

为了探究加系杜洛克日增重的遗传机理，并开发一种快速、高效的与日增重选育相关的分子育种技术，本发明利用83头杜洛克群体，通过全基因组关联(GWAS)分析等方法，发现并鉴别了一个影响加系杜洛克日增重的SNP位点，在此基础上，本发明还构建一种快速、高效的分子判型技术。通过深入研究了不同基因型对应的表型，确定了与日增重有关的基因型，通过对基因型的选择，可以加快加系杜洛克日增重的遗传进展。

1、实验动物 83头加系杜洛克实验群体，来源于杜洛克国家核心原种场。

83头加系杜洛克日增重表型值如图1所示，从图1可知表型值符合正态分布。

2、实验方法

DNA的提取/猪全基因组60K SNP判型

每头猪均采集一小块耳样，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，其具体步骤如下：

1、将耳样剪碎，放入1.5mlEP管中，加入350ul裂解液、20ul蛋白酶K和0.9ul RNaseA，混匀。

2、在热孵育器中，55℃过夜。(刚开始可每隔30min摇晃一次)

3、取出EP管，加入等体积Tris平衡苯酚，用力摇晃3min；12000g，离心10分钟。

4、轻轻吸取上清至一新的1.5mlEP管中。

5、向上清中加入等体积苯酚/氯仿，用力摇晃2分钟；12000g，离心2分钟。

6、吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，摇匀。

7、12000g，离心1分钟，尽可能吸除上层乙醇。

8、加入1ml，70％乙醇漂洗DNA，用力摇匀，以去除残留的SDS和苯酚；

9、12000g，离心1分钟，去除乙醇。

10、将EP管倒置在吸水纸上，以吸干乙醇。(9、10可重复一次)

11、用65℃预热的无菌ddH2O,35ul溶解DNA，-20℃保存。

经Nanodrop-NDIOOO分光光度计检测质量后统一将浓度稀释至50ng/μI,在Illumina Beadstation平台上根据公司标准流程进行猪全基因组60K SNP芯片(Illumina，美国)基因型判定。利用plink_1.09软件对所有样本60K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于95％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6的SNP，最终得到约4万个SNP的有效基因型数据。

全基因组关联(GWAS)分析

本实验的采用的83头杜洛克母猪均为加系杜洛克且来自一个场，因此不存在群体层化效应，用PLINK进行GWAS分析，基因组水平的显著区域采用保守的Bonferrini校正方法确定，即基因组显著水平阈值为＝0.05/40000(有效SNP数量)。

实验结果

GWAS分析结果(图2)。从图2可知，在83头杜洛克群体中，在猪13号染色体存在与加系杜洛克日增重相关的SNP位点：ASGA0056780(位于SSC13:27347572bp处)。GG基因型个体有更高的日增重。详见图3。表明ASGA0056780位点可以作为分子标记对加系杜洛克日增重进行选择。

该突变稳点可用以下序列检测：

引物序列

正向引物 AATAAGACACTGTTCTGAGGATGTAACAC

反向引物 TCATGGATCTGTGCGCTAAAGA

探针 ATGGAGAAAGGGCATAC。

引物和探针进行检测SNP的实验过程

实时定量Taqman PCR基因分型扩增体系：10μl反应体系含3.4μl水，5μl 2×Taqman Genotyping Master Mix，0.2μl 10mM正向引物，0.2μl 10mM反向引物，0.1μl 10mM探针1(5′-FAM,3′-TAMRA)，0.1μl 10mM探针2(5′-VIC,3′-TAMRA)，1μl DNA。

实时定量Taqman PCR反应程序：1、AD-pre read读取初始背景(本底)荧光信号。2、AQ-PCR扩增：50℃，2min；95℃，10min；(95℃，15sec，各引物退火及延伸温度60℃，1min)，40个循环。3、AD-post read读取PCR反应结束后荧光信号(终点读法)，除去本底信号，分析后自动分簇得到判型结果。

<110>1/广西柯新源原种猪有限责任公司，

2/漳州傲农现代农业开发有限公司，

3/福建傲农生物科技集团股份有限公司，

4/井冈山市傲新华富育种有限公司，

5/乐山傲农康瑞牧业有限公司，

6/湖北三匹畜牧科技有限公司，

7/德州傲新育种有限公司

<120>一种与加系杜洛克猪日增重相关的SNP分子标记及其应用

<160>3

210>1

<211>13

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>1

AATAAGACACTGTTCTGAGGATGTAACAC 13

<210>2

<211>11

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>2

TCATGGATCTGTGCGCTAAAGA 11

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>3

ATGGAGAAAGGGCATAC 16