1.一种牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法,其特征在于:包括如下步骤:
1)组织样品匀浆:取病贝外套膜和腮组织10-15g,经过滤海水洗涤2-5次,然后用剪刀剪碎组织;加入90-135ml的灭菌海水,使用组织匀浆器匀浆组织;
2)低速离心去除杂质:将步骤1)中得到组织匀浆液依次在250g、1000g和4000g离心力下离心;每次离心后去除沉淀,取上清液;
3)基因组DNA提取:以步骤2)中上清液180µL为靶物质,使用DNA提取试剂盒,提取DNA作为长片段PCR扩增的模板;
4)长片段PCR扩增:以步骤3)中提取得到DNA 1.0µL为模板,分别采用23对引物,在25µL体系中进行长片段PCR扩增;
5)PCR 扩增产物检测:取步骤4)得到的PCR 扩增产物4.5µL,加入1.5µL 的上样缓冲液混合后,在浓度为0.8%的琼脂糖凝胶中,110伏电压下电泳50 min;凝胶成像系统观察并拍照,存在约10Kb的特异性条带,则确定成功扩增。
2.根据权利要求1所述的牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法,其特征在于:步骤4)中,所述的25µL长片段PCR反应体系组成分如下:5×PCR缓冲液 5µL、dNTP 1.5-3µL、GXL DNA 聚合酶 0.5-1µL、浓度为10.0 µmol/L的上游引物和下游引物各0.5-1µL、DNA模板1-2µL,另外加超纯水12.5-15.5µL。
3.根据权利要求2所述的牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法,其特征在于:步骤4)中,所述的长片段PCR的程序如下:首先94 ℃预变性1min;然后98 ℃变性10s,50-54℃变性15s,68℃延伸10min,35个循环,4℃保存。
4.根据权利要求3所述的牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法,其特征在于:步骤4)中,所述长片段PCR所用的23对引物序列为:
G1F:CCCGCACACATACGCACTACATAAA
G1R:GGTTTCCAGTAGGGTGTTTAAGAGC
G2F:GCAATCCAGTTCCCAAACCAATAGG
G2R:ATCGCTTCCTATCACCTTGTGGTCT
G3F:CCGTGAAATATCTGCCAAGGTGTTG
G3R:CGACCAGGAGAACATGAACGACTTT
G4F:GCCCTCCTATTGGTACAAGATTGCT
G4R:GAGCACAAACACTACCGCATACATG
G5F:GCTTGTTTCTTGGTGTCTGAGGTCA
G5R:ATGGCAGAAATAGAAACCCGAGGTC
G6F:ATCCCAGTCTGTCAAATGCTCTCTC
G6R:CCAGATATGAAGAGGAAGGGATGTC
G7F:ATGCCTGGGCGTAATTGTCTCTTGA
G7R:CCAACTCTTCATCGTCACTCATCTC
G8F:GGGCGTTCACTTTAGACTTCCAATC
G8R:TTCCCTGGCGATACTCTCATAGACA
G9F:GGTCCGTCAACATCGAGAAAGAGAA
G9R:CACGATAAATATGCTGCCTGGGTCA
G10F:AGGGCGAGCATGGTCACATTTCAAA
G10R:GGGATATTCTGAGGGTTGTTGTGGA
G11F:GCCCAATAAACCTACAGAGGATGAG
G11R:ATGGCAGATTCAGGAGAGGGTTGTA
G12F:TGGCTTCTGTGGTGGTAGTTGTTGT
G12R:CGGCATTACCAAATATAGGCACACG
G13F:GGCACGCTCATTCTTACAACTCTTG
G13R:CAACCAATCAGATCGACGAGACTCA
G14-2F:GCGATGCCTTAATTGTTGCCAGAGT
G14-2R:TCCTGTGGAATGGTTGTTGGTGATG
G15F:GCAAACGAAAGAGCGGCTATAACAG
G15R:CTCCGTCATCGGTGTTATTACTAGG
G16F:GTCGGTTGTGGGTTTGGAAATGTAG
G16R:CTGGAAGCGAGTGTCAAGGTTAAAC
G17F:GCAGTTTGATTCATGTGTGGCAGAG
G17R:GCCATCCACCTCATATCCATTTCTC
G18F:GGATGATGGATTGTTGGACGAGAGA
G18R:GCTGCGGTCAGTACATGGTCATTTA
G19F:CGTGAAGACGCCATGAAGAGAAGTT
G19R:TCTGCCAGCCTCTGTGAACTTGTAA
G20F:TTGGCAGATGAGGACACCTTATACC
G20R:TTCCTGATTCCTCCACGCCATAACA
G21F:GGCAGCTAGTAAGGTCAATCTCAAC
G21R:TGGTTCCCTGGCGACGTTTACATAA
G22F:CGAAACGACAGGTTGAAGTGAGG
G22R:CAATGAATCGCCAATTAAGGAGG
G23F:CCATTTGTCAATCTCGGTTCTGC
G23R:GGAGGTGGGGTTTGAATACGAAG;
其中,引物序列方向均为5’到3’,F代表上游引物,R代表下游引物。