一种牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法与流程

文档序号:12097345阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法,其特征在于:包括如下步骤:

1)组织样品匀浆:取病贝外套膜和腮组织10-15g,经过滤海水洗涤2-5次,然后用剪刀剪碎组织;加入90-135ml的灭菌海水,使用组织匀浆器匀浆组织;

2)低速离心去除杂质:将步骤1)中得到组织匀浆液依次在250g、1000g和4000g离心力下离心;每次离心后去除沉淀,取上清液;

3)基因组DNA提取:以步骤2)中上清液180µL为靶物质,使用DNA提取试剂盒,提取DNA作为长片段PCR扩增的模板;

4)长片段PCR扩增:以步骤3)中提取得到DNA 1.0µL为模板,分别采用23对引物,在25µL体系中进行长片段PCR扩增;

5)PCR 扩增产物检测:取步骤4)得到的PCR 扩增产物4.5µL,加入1.5µL 的上样缓冲液混合后,在浓度为0.8%的琼脂糖凝胶中,110伏电压下电泳50 min;凝胶成像系统观察并拍照,存在约10Kb的特异性条带,则确定成功扩增。

2.根据权利要求1所述的牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法,其特征在于:步骤4)中,所述的25µL长片段PCR反应体系组成分如下:5×PCR缓冲液 5µL、dNTP 1.5-3µL、GXL DNA 聚合酶 0.5-1µL、浓度为10.0 µmol/L的上游引物和下游引物各0.5-1µL、DNA模板1-2µL,另外加超纯水12.5-15.5µL。

3.根据权利要求2所述的牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法,其特征在于:步骤4)中,所述的长片段PCR的程序如下:首先94 ℃预变性1min;然后98 ℃变性10s,50-54℃变性15s,68℃延伸10min,35个循环,4℃保存。

4.根据权利要求3所述的牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法,其特征在于:步骤4)中,所述长片段PCR所用的23对引物序列为:

G1F:CCCGCACACATACGCACTACATAAA

G1R:GGTTTCCAGTAGGGTGTTTAAGAGC

G2F:GCAATCCAGTTCCCAAACCAATAGG

G2R:ATCGCTTCCTATCACCTTGTGGTCT

G3F:CCGTGAAATATCTGCCAAGGTGTTG

G3R:CGACCAGGAGAACATGAACGACTTT

G4F:GCCCTCCTATTGGTACAAGATTGCT

G4R:GAGCACAAACACTACCGCATACATG

G5F:GCTTGTTTCTTGGTGTCTGAGGTCA

G5R:ATGGCAGAAATAGAAACCCGAGGTC

G6F:ATCCCAGTCTGTCAAATGCTCTCTC

G6R:CCAGATATGAAGAGGAAGGGATGTC

G7F:ATGCCTGGGCGTAATTGTCTCTTGA

G7R:CCAACTCTTCATCGTCACTCATCTC

G8F:GGGCGTTCACTTTAGACTTCCAATC

G8R:TTCCCTGGCGATACTCTCATAGACA

G9F:GGTCCGTCAACATCGAGAAAGAGAA

G9R:CACGATAAATATGCTGCCTGGGTCA

G10F:AGGGCGAGCATGGTCACATTTCAAA

G10R:GGGATATTCTGAGGGTTGTTGTGGA

G11F:GCCCAATAAACCTACAGAGGATGAG

G11R:ATGGCAGATTCAGGAGAGGGTTGTA

G12F:TGGCTTCTGTGGTGGTAGTTGTTGT

G12R:CGGCATTACCAAATATAGGCACACG

G13F:GGCACGCTCATTCTTACAACTCTTG

G13R:CAACCAATCAGATCGACGAGACTCA

G14-2F:GCGATGCCTTAATTGTTGCCAGAGT

G14-2R:TCCTGTGGAATGGTTGTTGGTGATG

G15F:GCAAACGAAAGAGCGGCTATAACAG

G15R:CTCCGTCATCGGTGTTATTACTAGG

G16F:GTCGGTTGTGGGTTTGGAAATGTAG

G16R:CTGGAAGCGAGTGTCAAGGTTAAAC

G17F:GCAGTTTGATTCATGTGTGGCAGAG

G17R:GCCATCCACCTCATATCCATTTCTC

G18F:GGATGATGGATTGTTGGACGAGAGA

G18R:GCTGCGGTCAGTACATGGTCATTTA

G19F:CGTGAAGACGCCATGAAGAGAAGTT

G19R:TCTGCCAGCCTCTGTGAACTTGTAA

G20F:TTGGCAGATGAGGACACCTTATACC

G20R:TTCCTGATTCCTCCACGCCATAACA

G21F:GGCAGCTAGTAAGGTCAATCTCAAC

G21R:TGGTTCCCTGGCGACGTTTACATAA

G22F:CGAAACGACAGGTTGAAGTGAGG

G22R:CAATGAATCGCCAATTAAGGAGG

G23F:CCATTTGTCAATCTCGGTTCTGC

G23R:GGAGGTGGGGTTTGAATACGAAG;

其中,引物序列方向均为5’到3’,F代表上游引物,R代表下游引物。

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