一种牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过长片段聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）对牡蛎疱疹病毒（Ostreid herpesvirus1,OsHV-1）全基因组DNA的富集方法。

背景技术：

牡蛎疱疹病毒是首个被发现感染无脊椎动物的疱疹病毒，该病毒最早报道于1991年，目前已引起包括我国在内的全球11个国家和地区的多种海水养殖双壳贝类的大规模死亡。由于无脊椎动物疱疹病毒发现和研究起步晚，又缺乏无脊椎动物细胞的体外培养和建系技术，还无法得到纯净的牡蛎疱疹病毒粒子或其基因组DNA。这一缺陷严重阻碍了牡蛎疱疹病毒相关研究的推进，以及基于核酸的分子检测方法的改进。

目前人和脊椎动物疱疹病毒粒子和全基因组DNA的富集，主要通过两种途径完成：一是疱疹病毒人工感染体外培养的细胞系增殖后进行纯化，二是基于RNA探针的靶序列富集技术。但这两种方法的应用都有一定的前提条件，体外培养细胞系增殖纯化需要有宿主细胞的体外培养和建系技术，靶序列富集技术需要有商品化的RNA探针。如前所述，目前还不掌握无脊椎动物细胞的体外培养方法，而商品化的RNA探针也仅限于部分人疱疹病毒。因此，上述技术都不能应用到包括牡蛎疱疹病毒在内的无脊椎动物疱疹病毒基因组DNA富集工作中去。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法，可弥补现有技术的空白；同时，该技术对其他无脊椎动物疱疹病毒等双链DNA病毒全基因组DNA的富集也有极好的借鉴作用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：1）组织样品匀浆：取病贝外套膜和腮组织10-15g，经过滤海水洗涤2-5次，然后用剪刀剪碎组织；加入90-135ml的灭菌海水，使用组织匀浆器匀浆组织；2）低速离心去除杂质：将步骤1）中得到组织匀浆液依次在250g、1000g和4000g离心力下离心；每次离心后去除沉淀，取上清液；3）基因组DNA提取：以步骤2）中上清液180µL为靶物质，使用DNA提取试剂盒，提取DNA作为长片段PCR扩增的模板；4）长片段PCR扩增：以步骤3）中提取得到DNA 1.0µL为模板，分别采用23对引物，在25µL体系中进行长片段PCR扩增；5）PCR 扩增产物检测：取步骤4）得到的PCR 扩增产物4.5µL，加入1.5µL 的上样缓冲液混合后，在浓度为0.8%的琼脂糖凝胶中，110伏电压下电泳50 min；凝胶成像系统观察并拍照，存在约10Kb的特异性条带，则确定成功扩增。

优选的，在所述步骤4）中，所述的25µL长片段PCR反应体系组成分如下：5×PCR缓冲液 5µL、dNTP 1.5-3µL、GXL DNA 聚合酶 0.5-1µL、浓度为10.0 µmol/L的上游引物和下游引物各0.5-1µL、DNA模板1-2µL，另外加超纯水12.5-15.5µL。

优选的，在所述步骤4）中，所述的长片段PCR的程序如下：首先94 ℃预变性1 min；然后98 ℃变性10 s，50-54℃变性15 s，68℃延伸10min，35个循环，4℃保存。

优选的，在所述步骤4）中，所述长片段PCR所用的23对引物序列为：

G1F：CCCGCACACATACGCACTACATAAA

G1R：GGTTTCCAGTAGGGTGTTTAAGAGC

G2F：GCAATCCAGTTCCCAAACCAATAGG

G2R：ATCGCTTCCTATCACCTTGTGGTCT

G3F：CCGTGAAATATCTGCCAAGGTGTTG

G3R：CGACCAGGAGAACATGAACGACTTT

G4F：GCCCTCCTATTGGTACAAGATTGCT

G4R：GAGCACAAACACTACCGCATACATG

G5F：GCTTGTTTCTTGGTGTCTGAGGTCA

G5R：ATGGCAGAAATAGAAACCCGAGGTC

G6F：ATCCCAGTCTGTCAAATGCTCTCTC

G6R：CCAGATATGAAGAGGAAGGGATGTC

G7F：ATGCCTGGGCGTAATTGTCTCTTGA

G7R：CCAACTCTTCATCGTCACTCATCTC

G8F：GGGCGTTCACTTTAGACTTCCAATC

G8R：TTCCCTGGCGATACTCTCATAGACA

G9F：GGTCCGTCAACATCGAGAAAGAGAA

G9R：CACGATAAATATGCTGCCTGGGTCA

G10F：AGGGCGAGCATGGTCACATTTCAAA

G10R：GGGATATTCTGAGGGTTGTTGTGGA

G11F：GCCCAATAAACCTACAGAGGATGAG

G11R：ATGGCAGATTCAGGAGAGGGTTGTA

G12F：TGGCTTCTGTGGTGGTAGTTGTTGT

G12R：CGGCATTACCAAATATAGGCACACG

G13F：GGCACGCTCATTCTTACAACTCTTG

G13R：CAACCAATCAGATCGACGAGACTCA

G14-2F：GCGATGCCTTAATTGTTGCCAGAGT

G14-2R：TCCTGTGGAATGGTTGTTGGTGATG

G15F：GCAAACGAAAGAGCGGCTATAACAG

G15R：CTCCGTCATCGGTGTTATTACTAGG

G16F：GTCGGTTGTGGGTTTGGAAATGTAG

G16R：CTGGAAGCGAGTGTCAAGGTTAAAC

G17F：GCAGTTTGATTCATGTGTGGCAGAG

G17R：GCCATCCACCTCATATCCATTTCTC

G18F：GGATGATGGATTGTTGGACGAGAGA

G18R：GCTGCGGTCAGTACATGGTCATTTA

G19F：CGTGAAGACGCCATGAAGAGAAGTT

G19R：TCTGCCAGCCTCTGTGAACTTGTAA

G20F：TTGGCAGATGAGGACACCTTATACC

G20R：TTCCTGATTCCTCCACGCCATAACA

G21F：GGCAGCTAGTAAGGTCAATCTCAAC

G21R：TGGTTCCCTGGCGACGTTTACATAA

G22F：CGAAACGACAGGTTGAAGTGAGG

G22R：CAATGAATCGCCAATTAAGGAGG

G23F：CCATTTGTCAATCTCGGTTCTGC

G23R：GGAGGTGGGGTTTGAATACGAAG；其中，引物序列方向均为5’到3’，F代表上游引物，R代表下游引物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明是以牡蛎疱疹病毒种内相对保守的基因序列为模板，设计23对长片段PCR用引物。这些引物可以特异性地覆盖牡蛎疱疹病毒全基因组，并被经过优化的长片段PCR反应体系和程序所扩增，完成对对牡蛎疱疹病毒基因组DNA富集的目的，克服了之前无法富集和纯化病毒基因组DNA的问题。同时，该方法不仅可以用于新鲜组织样本内牡蛎疱疹病毒基因组DNA的富集，也可以用于冷冻保存组织样本内牡蛎疱疹病毒基因组DNA的富集。

附图说明

图1：栉孔扇贝感染牡蛎疱疹病毒长片段PCR扩增产物电泳图；M：Trans15K DNA Marker；1-23：使用第1至23对长片段PCR引物（见表1），扩增得到的PCR产物；

图2：健康栉孔扇贝长片段PCR扩增产物电泳图；M：Trans15K DNA Marker；1-23：使用第1至23对长片段PCR引物（见表1），扩增得到的PCR产物；

图3：魁蚶感染牡蛎疱疹病毒长片段PCR扩增产物电泳图；M：Trans15K DNA Marker；1-23：使用第1至23对长片段PCR引物（见表1），扩增得到的PCR产物；

图4：新鲜魁蚶感染牡蛎疱疹病毒长片段PCR扩增产物电泳图；M：Trans15K DNA Marker；1-23：使用第1至23对长片段PCR引物（见表1），扩增得到的PCR产物。

具体实施方式

下面结合附图实施例，对本发明做进一步描述：

如图1、2、3、4所示，一种牡蛎疱疹病毒全基因组DNA富集方法，包括如下步骤：1）组织样品匀浆：取病贝外套膜和腮组织10-15g，经过滤海水洗涤2-5次，然后用剪刀剪碎组织；加入90-135ml的灭菌海水，使用组织匀浆器匀浆组织；2）低速离心去除杂质：将步骤1）中得到组织匀浆液依次分别在250g、1000g和4000g离心力下离心；每次离心后去除沉淀，取上清液；3）基因组DNA提取：以步骤2）中上清液180µL为靶物质，使用DNA提取试剂盒，提取DNA作为长片段PCR扩增的模板；4）长片段PCR扩增：以步骤3）中提取得到DNA 1.0µL为模板，分别采用23对引物，在25µL体系中进行长片段PCR扩增；5）PCR 扩增产物检测：取步骤4）得到的PCR 扩增产物4.5µL，加入1.5µL 的上样缓冲液混合后，在浓度为0.8%的琼脂糖凝胶中，110伏电压下电泳50 min；凝胶成像系统观察并拍照，存在约10Kb的特异性条带，则确定成功扩增。

步骤4）中，所述的25µL长片段PCR反应体系组成分如下：5×PCR缓冲液 5µL、dNTP 1.5-3µL、GXL DNA 聚合酶 0.5-1µL、浓度为10.0 µmol/L的上游引物和下游引物各0.5-1µL、DNA模板1-2µL，另外加超纯水12.5-15.5µL。

在步骤4）中长片段PCR的程序如下：首先94 ℃预变性1 min；然后98 ℃变性10 s，50-54℃变性15 s，68℃延伸10min，35个循环，4℃保存。

步骤4）中的长片段PCR所用的23对引物序列为：

G1F：CCCGCACACATACGCACTACATAAA

G1R：GGTTTCCAGTAGGGTGTTTAAGAGC

G2F：GCAATCCAGTTCCCAAACCAATAGG

G2R：ATCGCTTCCTATCACCTTGTGGTCT

G3F：CCGTGAAATATCTGCCAAGGTGTTG

G3R：CGACCAGGAGAACATGAACGACTTT

G4F：GCCCTCCTATTGGTACAAGATTGCT

G4R：GAGCACAAACACTACCGCATACATG

G5F：GCTTGTTTCTTGGTGTCTGAGGTCA

G5R：ATGGCAGAAATAGAAACCCGAGGTC

G6F：ATCCCAGTCTGTCAAATGCTCTCTC

G6R：CCAGATATGAAGAGGAAGGGATGTC

G7F：ATGCCTGGGCGTAATTGTCTCTTGA

G7R：CCAACTCTTCATCGTCACTCATCTC

G8F：GGGCGTTCACTTTAGACTTCCAATC

G8R：TTCCCTGGCGATACTCTCATAGACA

G9F：GGTCCGTCAACATCGAGAAAGAGAA

G9R：CACGATAAATATGCTGCCTGGGTCA

G10F：AGGGCGAGCATGGTCACATTTCAAA

G10R：GGGATATTCTGAGGGTTGTTGTGGA

G11F：GCCCAATAAACCTACAGAGGATGAG

G11R：ATGGCAGATTCAGGAGAGGGTTGTA

G12F：TGGCTTCTGTGGTGGTAGTTGTTGT

G12R：CGGCATTACCAAATATAGGCACACG

G13F：GGCACGCTCATTCTTACAACTCTTG

G13R：CAACCAATCAGATCGACGAGACTCA

G14-2F：GCGATGCCTTAATTGTTGCCAGAGT

G14-2R：TCCTGTGGAATGGTTGTTGGTGATG

G15F：GCAAACGAAAGAGCGGCTATAACAG

G15R：CTCCGTCATCGGTGTTATTACTAGG

G16F：GTCGGTTGTGGGTTTGGAAATGTAG

G16R：CTGGAAGCGAGTGTCAAGGTTAAAC

G17F：GCAGTTTGATTCATGTGTGGCAGAG

G17R：GCCATCCACCTCATATCCATTTCTC

G18F：GGATGATGGATTGTTGGACGAGAGA

G18R：GCTGCGGTCAGTACATGGTCATTTA

G19F：CGTGAAGACGCCATGAAGAGAAGTT

G19R：TCTGCCAGCCTCTGTGAACTTGTAA

G20F：TTGGCAGATGAGGACACCTTATACC

G20R：TTCCTGATTCCTCCACGCCATAACA

G21F：GGCAGCTAGTAAGGTCAATCTCAAC

G21R：TGGTTCCCTGGCGACGTTTACATAA

G22F：CGAAACGACAGGTTGAAGTGAGG

G22R：CAATGAATCGCCAATTAAGGAGG

G23F：CCATTTGTCAATCTCGGTTCTGC

G23R：GGAGGTGGGGTTTGAATACGAAG；其中，引物序列方向均为5’到3’，F代表上游引物，R代表下游引物。

实施例一

栉孔扇贝感染牡蛎疱疹病毒基因组DNA的富集

1. 组织样品匀浆

取感染（患病）和未感染（健康）牡蛎疱疹病毒栉孔扇贝外套膜和腮组织各10g，经过滤海水洗涤3次，用剪刀剪至约3mm³大小碎块；

按1：9（w/v）的比例加入90ml的灭菌海水，使用组织匀浆器匀浆组织：最大转速，匀浆3次，每次10秒。

2.低速离心去除宿主组织和细胞

将上述得到的组织匀浆液依次经过250g、1000g和4000g离心力离心20min；每次离心后去除沉淀，取上清液。

3.上清液DNA提取

取最后一次离心后得到的上清液各180 µL，使用DNeasy^® 血液&组织DNA提取试剂盒提取DNA作为模板。

4.长片段PCR扩增

使用Takara PrimeSTAR^® GXL DNA 聚合酶及配套的缓冲液，配制成25 µL的PCR反应体系，其具体成分如下：5×PCR缓冲液 5 µL、dNTP 2µL、GXL DNA 聚合酶 0.5µL、浓度为10.0 µmol/L的上游引物和下游引物各0.5µL、DNA模板 1 µL，另外加超纯水15.5µL。

所用的PCR反应程序为：首先94 ℃预变性1 min；然后98 ℃变性10 s，50℃变性15 s，68℃延伸10min，35个循环，4℃保存。

5. PCR扩增产物检测

取步骤4中的PCR 扩增产物各4.5 µL，加入1.5µL 的上样缓冲液(GeneFinder与6×loading buffer按1∶9体积混合)混合后，在浓度为0.8%的琼脂糖凝胶中，110伏电压下电泳50 min；通过凝胶成像系统观察是否存在10 Kb左右的特异性条带。

图1和2分别示感染和未感染栉孔扇贝组织DNA长片段PCR扩增结果。

实施例二

魁蚶感染牡蛎疱疹病毒基因组DNA的富集

1. 组织样品匀浆

取感染牡蛎疱疹病毒魁蚶外套膜和腮组织15g经过滤海水洗涤4次，用剪刀剪至约3 mm³大小碎块；

按1：9（w/v）的比例加入135ml的灭菌海水，使用组织匀浆器匀浆组织：最大转速，匀浆3次，每次10秒。

2.低速离心去除宿主组织和细胞

将上述得到的组织匀浆液依次经过250g、1000g和4000g离心力离心20min；每次离心后去除沉淀，取上清液。

3.上清液DNA提取

取最后一次离心后得到的上清液180µL，使用DNeasy^® 血液&组织DNA提取试剂盒提取DNA作为模板。

4.长片段PCR扩增

使用Takara PrimeSTAR^® GXL DNA 聚合酶及配套的缓冲液，配制成25 µL的PCR反应体系，其具体成分如下：5×PCR缓冲液 5 µL、dNTP 3µL、GXL DNA 聚合酶 1µL、浓度为10.0 µmol/L的上游引物和下游引物各0.75µL、DNA模板 2 µL，另外加超纯水12.5µL。

所用的PCR反应程序为：首先94 ℃预变性1 min；然后98 ℃变性10 s，54℃变性15 s，68℃延伸10min，35个循环，4℃保存。

5. PCR扩增产物检测

取步骤4中的PCR 扩增产物各4.5µL，加入1.5µL 的上样缓冲液(GeneFinder与6×loading buffer按1∶9体积混合)混合后，在浓度为0.8%的琼脂糖凝胶中，110伏电压下电泳50 min；通过凝胶成像系统观察是否存在10 Kb左右的特异性条带。如图3所示。

实施例三

新鲜魁蚶感染牡蛎疱疹病毒基因组DNA的富集

1. 组织样品匀浆

取感染牡蛎疱疹病毒魁蚶外套膜和腮组织12g经过滤海水洗涤4次，用剪刀剪至约3 mm³大小碎块；

按1：9（w/v）的比例加入108ml灭菌海水，使用组织匀浆器匀浆组织：最大转速，匀浆3次，每次10秒。

2.低速离心去除宿主组织和细胞

将上述得到的组织匀浆液依次经过250g、1000g和4000g离心力离心20min；每次离心后去除沉淀，取上清液。

3.上清液DNA提取

取最后一次离心后得到的上清液180µL，使用DNeasy^® 血液&组织DNA提取试剂盒提取DNA作为模板。

4.长片段PCR扩增

使用Takara PrimeSTAR^® GXL DNA 聚合酶及配套的缓冲液，配制成25 µL的PCR反应体系，其具体成分如下：5×PCR缓冲液 5µL、dNTP 1.5µL、GXL DNA 聚合酶 1µL、浓度为10.0 µmol/L的上游引物和下游引物各1 µL、DNA模板 1 µL，另外加超纯水14.5µL。

所用的PCR反应程序为：首先94 ℃预变性1 min；然后98℃变性10s，52.5℃变性15 s，68℃延伸10min，35个循环，4℃保存。

5. PCR扩增产物检测

取步骤4中的PCR 扩增产物各4.5 µL，加入1.5µL 的上样缓冲液(GeneFinder与6×loading buffer按1∶9体积混合)混合后，在浓度为0.8%的琼脂糖凝胶中，110伏电压下电泳50 min；通过凝胶成像系统观察是否存在10 Kb左右的特异性条带。如图4所示。

本发明其次提供一套牡蛎疱疹病毒全基因组DNA的长片段PCR扩增技术。该技术的核心是从众多尽心设计和反复实验验证后，得到的23对长片段PCR引物。这些引物满足以下条件：均来位于牡蛎疱疹病毒基因组的保守区，可以覆盖整个病毒基因组，具有相似的溶解温度（TM值）和扩增长度（10-13Kb），后续PCR可使用同一PCR反应体系和扩增条件，使操作过程更加快速和便捷。同时，还选出了最适合本发明实际应用条件的DNA聚合酶，扩增体系和PCR反应程序。申请人在对牡蛎疱疹病毒已公布三个变异株基因组进行全局比对后，发现该病毒种内核苷酸序列相似度达到95%以上；这一基因组高度保守性，为发明人设计既能覆盖病毒全基因组，又具有较高保守性的长片段PCR引物提供了基础。在实验过程中，发明人为了克服宿主DNA对长片段PCR造成的干扰问题；开创性的提出采用组织匀浆和差速离心的方法去除大部分宿主组织和细胞，然后再提取DNA用于下游操作。这一组织预处理方法的使用，有效的保障了长片段PCR的扩增的效率和稳定性，是该发明顺利实施的重要一环。然后结合文献报道和发明人现场实验结果，从3种常用的长片段PCR扩增用聚合酶中，筛选出稳定性和扩增效率高的Takara PrimeSTAR^® GXL DNA 聚合酶。最后通过优化PCR扩增体系和程序，成功建立了牡蛎疱疹病毒的全基因组DNA富集方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。