一种基于LED技术的调节黑素细胞色素合成的方法与流程

本发明属于生物技术及光疗应用领域，具体涉及一种新的基于发光二极管(LED)技术调节黑素细胞色素合成的方法，本发明中通过确定的高纯度单波谱的LED光，调节黑素细胞色素合成，同时不影响黑素细胞的增殖凋亡。本方法能为色素障碍性疾病的体外研究提供新的模型，以及能为色素障碍性疾病的临床治疗提供新的思路。

背景技术：

现有技术公开了黑素细胞是定居于皮肤真表皮交界处的一种树突样细胞，其产生并输送到周围角质细胞中的黑色素决定了皮肤和毛发的颜色。研究报道，黑素细胞异常会导致种类繁多的色素性皮肤病,色素减退如白癜风、无色素痣、斑驳病等，色素加深如黄褐斑、雀斑、炎症后色素沉着等。实践显示，所述的色素性皮肤病发病率高，对人们的身心健康已带来很大影响，与此同时，由于其病因复杂，确切发病机制尚不明了，且目前的治疗效果尚不尽人意，因此进一步阐明黑素细胞生物学特性，探索调节黑素细胞色素合成的影响因素，已成为本技术领域研究人员的关注点，目前，临床研究实践中尚缺乏有效的针对色素障碍性疾病的体外研究的细胞模型。

LED被称为第四代照明光源、绿色光源，具有节能、环保、寿命长、体积小等特点，已经被广泛应用于各种指示、显示、装饰、背光源、普通照明和城市景观照明等领域。世界上一些经济发达国家围绕LED的研制展开了激烈的技术竞赛。美国从2000年起投资5亿美元实施“国家半导体照明计划”，欧盟也在2000年7月宣布启动类似的“彩虹计划”。我国科技部在“863”计划的支持下，2003年6月份首次提出发展半导体照明计划。多年来，LED照明以其节能、环保的优势，已受到国家和各级政府的重视，各地纷纷出台相关政策和举措加快LED灯的发展。

在皮肤科治疗领域，常采用光源用于技术辅助，目前临床研究实践中采用的光源以激光、强脉冲光(IPL)为主，近年来LED作为一种新型的光源也备受关注。LED光调作用作为近几年的研究热点，已经在其抗炎作用、促进毛发生长、促进伤口愈合、治疗痤疮、治疗瘢痕疙瘩等多个方面得到了广泛认可。多项研究表明，光调作用可以通过增加胶原合成、减少金属蛋白酶(MMP)的产生来改善皮肤衰老。在Weiss等进行的一项临床试验中，90例患者应用590nm脉冲式LED进行治疗,治疗周期为每周2次,共8周，结果显示，90％的患者光老化症状改善,表现为肤质改善,眶周皱纹减少,皮肤红斑、色素明显减轻。另一研究发现,非热作用 的LED与非剥脱性激光联合治疗光老化,不仅能产生协同作用,并通过LED抗炎作用,减轻了激光术后出现的红斑反应。Alster等进行的一项临床试验中，20例患者接受全脸1550nm掺铒光纤激光换肤治疗，治疗后部分面部区域立即予590nm LED照射,结果显示24小时后，20例患者LED治疗区域红斑均较对照区减少,其中6例接受较高能量密度点阵治疗的患者,48小时后LED治疗区域红斑较对照区进一步减少，提示LED光调作用能降低点阵激光术后产生红斑的程度和持续时间，并减轻激光治疗后的炎症后并发症。

目前LED光调作用在色素性疾病中的应用鲜有报道，关于光调作用的研究主要针对成纤维细胞、白细胞、巨噬细胞、肥大细胞、角质形成细胞，因此，基于LED技术的发展及应用，以及LED光照对于皮肤色素影响研究的现状，本申请的发明人拟提供一种调节黑素细胞色素合成的新方法，进一步，研究LED光对黑素细胞生物学特性的影响，从而为建立一种色素障碍性疾病体外研究的新模型，以及在色素障碍性疾病的治疗与医疗美容方面提供重要支持。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中光照对于皮肤色素影响研究的现状，提供一种调节黑素细胞色素合成的方法，尤其是一种基于LED技术的调节黑素细胞色素合成的方法。本发明方法中通过确定的高纯度单波谱的LED光，调节黑素细胞色素合成，同时不影响黑素细胞的增殖凋亡。

采用本方法可进一步扩展LED光在科研和临床中的应用价值，为黑素细胞的体外研究提供新的研究模型，为色素障碍性疾病的治疗与辅助治疗提供理论与实践基础，为非剥脱医疗美容的发展提供新的参考数据。

具体的，本发明公开了一种基于LED技术的调节黑素细胞色素合成的方法，其中，采用特定波长的LED黄光，和特定照射剂量，连续照射分离，培养，纯化的人黑素细胞，调节黑素细胞色素合成，同时不影响黑素细胞的增殖凋亡。

本发明进一步提供了本方法在用于制备黑素细胞的体外研究模型中的用途，以及在用于制订治疗与辅助治疗色素障碍性疾病的干预措施中的用途，和用于制订非剥脱医疗美容干预措施中的用途。

采用本发明方法能抑制黑素细胞内酪氨酸酶活性，抑制黑素小体成熟(黑素细胞III-IV期成熟色素颗粒减少)，减少黑素含量，抑制黑素合成相关基因及蛋白的表达，同时不影响黑素细胞的增殖凋亡。

本发明中，通过步、步筛选，确定LED黄光其波长为585±5nm；

本发明中，优选采用LED黄光的光强为18mw/cm²，照射剂量为20J/cm²以内；

本发明中，进行了实验，采用特定波长的LED黄光，特定照射剂量，连续照射分离、培养、纯化的人黑素细胞，结果显示，通过本方法调节黑素细胞色素合成，能抑制黑素细胞内酪氨酸酶活性，抑制黑素小体成熟(黑素细胞III-IV期成熟色素颗粒减少)，减少黑素含量，抑制黑素合成相关基因及蛋白的表达，同时不影响黑素细胞的增殖凋亡。

更具体的，本发明的一种基于LED技术的调节黑素细胞色素合成的方法，其特征在于，其包括，采用特定波长的LED黄光，采用特定照射剂量，连续照射分离，培养，纯化的人黑素细胞，调节黑素细胞色素合成；通过下述步骤：

1)分离、培养、纯化人正常原代黑素细胞：

按改良郑氏法制备黑素细胞单细胞悬液，接种于培养瓶中，通过两次传代，得纯的黑素细胞；

2)LED光安全性筛选：

(1)LED光干预：分别使用单波谱、高纯度的红光、黄光，蓝光，不同能量梯度连续照射培养获得的黑素细胞5天；

本发明的实施例中，分别使用的单波谱、高纯度的红光为，635±5nm，115mw/cm²，0-103J；黄光为，585±5nm，18mw/cm²，0-40J；蓝光为，420±5nm，75mw/cm²，0-30J；

(2)筛选LED光对黑素细胞增殖和凋亡无影响的波谱及能量范围：

使用光学显微镜观察细胞形态，CCK-8法、流式细胞仪法测定黑素细胞的增殖和凋亡，评价不同波谱LED光照射对体外培养的黑素细胞活性的影响，筛选出对黑素细胞增殖和凋亡无影响的波谱及能量范围的LED光为：LED黄光，585±5nm，0-20J/cm²；LED蓝光，420±5nm，0-10J/cm²；

3)根据步骤2)的筛选结果，进一步筛选：

进行LED黄光和蓝光不同能量值与调节色素合成相关性的实验：LED黄光，585±5nm，18mw/cm²，0J、5J、10J、20J；LED蓝光，420±5nm，75mw/cm²，0J、5J、10J；分别连续照射黑素细胞5天，通过透射电子显微镜对黑素细胞黑素小体数量及成熟度的变化进行观察、数据统计，再采用PCR、western blot对黑素细胞色素合成相关蛋白MITF、TYR、TRP-1进行测定，筛选确定有效调节黑素细胞色素减少的LED光及能量值范围为LED黄光585±5nm，光强为18mw/cm²，照射剂量为20J/cm²以内。

本发明提供了一种基于LED技术调节黑素细胞色素合成的新方法，本方法的实施例中，优选采用波长为585±5nm，光强为18mw/cm^2，能量范围在20J/cm²的LED黄光连续照射黑素细胞，可抑制黑素细胞内酪氨酸酶活性，抑制黑素小体成熟(黑素细胞III-IV期成熟色素颗 粒减少)，抑制黑素合成相关基因及蛋白的表达，减少黑素含量，同时不影响黑素细胞的增殖凋亡；本发明方法安全有效，可用于制备黑素细胞的体外研究模型。

另一方面，基于目前临床实践中对于色素增加性疾病，如黄褐斑、炎症后色素沉着等的治疗方法繁多，但疗效有限，如黄褐斑目前以预防(防晒)为主，还可结合药物治疗以及进行激光治疗，但传统激光疗法因常产生炎症后色素沉着及复发等副作用，因此临床实践中通常不推荐用于黄褐斑的一线干预治疗；本发明采用所述的调节黑素细胞色素合成的方法进行了临床试验，结果显示，采用LED黄光(585±5nm)20J/cm²，每周一次，连续10周照射，对于部分黄褐斑患者具有良好的改善与疗效，表明本发明方法可用于疾病光疗和医学美容领域，尤其有助于制订治疗与辅助治疗色素障碍性疾病的干预措施，和用于制订非剥脱医疗美容干预措施。

本发明的优点有：

1，采用的低能量窄谱光源LED的光疗技术温和自然、面积大、副作用小。

2，对于建立色素障碍性疾病体外研究的细胞模型能提供技术支持。

3，能广泛用于治疗色素障碍性疾病，不仅能单独应用于临床，还能协同其它激光美容技术，增强其疗效，并改善激光术后的炎症反应，加快损伤的修复。

4、对于制定色素障碍性疾病新的干预治疗与辅助干预治疗方案有至关重要的意义。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1：光学显微镜下观察人原代黑素细胞形态学特征，其中，

A：放大倍数×100，B：放大倍数×200。

图2：流式细胞仪检.测LED红、黄、蓝光照射对人表皮黑素细胞凋亡的影响。

图3：电镜下观察不同能量LED黄光(585±5nm)对黑素小体的影响，其中，A1、A2为未经光照的黑素细胞，B1、B2为经黄光10J/cm²照射后的黑素细胞，C1、C2为经黄光20J/cm²照射后的黑素细胞，I-II期为不呈黑色的未成熟黑素小体，图中染成黑色的为Ⅲ-Ⅳ期成熟的黑素小体。

图4：不同能量LED黄光对黑素合成重要蛋白酪氨酸酶表达量的影响，其中，A为RT-PCR 测酪氨酸酶mRNA的表达量，B为westen-blot测得酪氨酸酶蛋白的表达。

图5：LED黄光(585±5nm)临床试验治疗黄褐斑疗效分析，其中，A为治疗前，B为治疗后。

具体实施方式

实施例1、基于LED技术的调节黑素细胞色素合成的试验

1、正常人原代黑素细胞的分离与培养

制备正常人原代黑素细胞单细胞悬液:获得的离体的正常人皮肤组织于75％乙醇溶液中浸泡30sec，然后用PBS清洗3-4遍至无血，无菌条件下去除皮下组织、血管及部分真皮，修成1mm×5mm的细条，移至0.5％dispase 4℃消化16h，血清终止消化，经分离表皮和真皮，去除真皮，将得到的表皮置于0.25％胰酶-0.02％EDTA37℃孵育10min，敲打表皮基底层，用吸管吹打成单细胞悬液；200μm筛网过滤，1500r/min离心7min，弃上清，加入5ml含1％HMGS的Medium-254，按5×10⁵/瓶的密度接种于25cm²培养瓶中，37℃、5％CO₂培养，3天换液1次；

黑素细胞的传代与纯化培养：黑素细胞生长近70％-80％融合时，弃去培养瓶中的黑素细胞培养液，经PBS液冲洗两次后，加入2ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃条件下孵育3-5min；在相差显微镜下观察黑素细胞形态变化，当大多数细胞树突缩短、胞体彼此分离、细胞变圆悬浮时，加入10％FBS血清终止消化，将细胞悬液移至离心管中2200g离心5min后，弃去上清液，PBS溶液冲洗两次，加入黑素细胞培养液，吹打均匀并细胞计数后移至细胞培养瓶，37℃、5％CO₂培养，3天换液1次；传代2次得到纯的黑素细胞；

2、不同波长LED光连续照射黑素细胞

LED光干预：使用单波谱、高纯度的红光(635±5nm，115mw/cm²)(0-103J)、黄光(585±5nm，18mw/cm²)(0-40J)，蓝光(42±50nm，75mw/cm²)(0-30J)，不同能量梯度，分别照射黑素细胞，连续照射5天；

CCK-8细胞活性实验、Annexin V/PI双色标记法检测黑素细胞增殖、凋亡情况：

Annexin V-APC/PI双色标记法检测黑素细胞凋亡情况：收集LED干预组和对照组的黑素细胞，调细胞密度为10⁶个/ml；PBS洗涤离心2000rpm/5min，共2次，弃上清，细胞重悬于500μl的标记缓冲液中，每管分别加AnnexinV-APC溶液和PI溶液各5μl，混匀后于室温下避光孵育15min；流式细胞仪检测细胞凋亡情况；每个样品检测1万个细胞，用cellquest软件进行细胞凋亡分析；

CCK-8法检测细胞增殖活性：LED干预组和对照组的黑素细胞，分别接种至96孔板，每孔1Χ10³个，每组设3个复孔，空白孔不加细胞，只加培养基。5％CO₂，37℃培养箱培 养48h弃去上清液，PH7.4的不含Ca2+和Mg2+的PBS洗2次；每孔加入CCK-850ul，5％CO₂，37℃培养箱培养4h；置酶标仪于450nm波长测吸收光光度值(A值)；细胞增殖率＝(A450照射组-A450空白组)/(A450对照组-A450空白组)×100％，重复3次；

结果显示，不同波长LED光连续5天照射黑素细胞后，黄光(585±5nm)20J/cm²以内,蓝光(420±5nm)低能量5、10J/cm²对细胞凋亡无明显影响(如图2所示)；

3，电镜观察黑素小体

取LED照射后的黑素细胞，吸去纯化的MC培养基，PBS洗3次，胰酶消化，100r/min，离心5min，弃上清，取细胞团块，加入新配置的预冷2.5％戊二醛0.5ml，4℃固定1.5h或更长时间，用0.1M磷酸缓冲液漂洗20min×3次，再加入2％锇酸固定液固定1.5h，用0.1M磷酸缓冲液漂洗15min×3次，依次加入乙醇按梯度脱水，30％乙醇5min，50％乙醇5min，70％乙醇10min，80％乙醇15min，95％乙醇15min，100％乙醇(无水硫酸钠处理)20min×2次，100％丙酮(无水硫酸钠处理)15min×3次。纯丙酮+包埋液(1:2)室温1-1.5h，纯包埋液室温过夜，用812包埋剂将样品包埋在包埋槽，60℃烘箱内48h，超薄切片机切片70nm，2％醋酸铀-柠檬酸铅双染色，透射电镜观察，拍片；

图3显示了电镜观察结果，其中A1、A2为未经光照的黑素细胞，B1、B2为经黄光10J/cm²照射后的黑素细胞，C1、C2为经黄光20J/cm²照射后的黑素细胞，I-II期为不呈黑色的未成熟黑素小体，染色呈黑色的为Ⅲ-Ⅳ期成熟的黑素小体；结果表明，未经光照的黑素细胞中成熟黑素小体较多，占79±8％；经黄光10J/cm²照射后成熟的黑素小体减少至51±8％；且抑制黑素小体成熟的作用在黄光能量达到20J/cm²时更为明显，Ⅲ-Ⅳ期成熟的黑素小体比例降至24±7％；

4，Western blot检测不同能量LED黄光对黑素合成重要蛋白酪氨酸酶表达量

电泳：制备SDS-PAGE电泳凝胶，样品中加上样缓冲液，冷却至室温后，将蛋白样品上样至凝胶进行电泳；

转膜：电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次；

将制得的与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min，转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放置，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压重物，将碳板上多余的液体吸干；接通电源，恒流300mA，转移1.5h后，取膜；

抗体孵育：裁取待测膜条，用0.01M PBS洗膜，5min×3次，加入封闭液，平稳摇动，室温2h，弃封闭液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次；加入兔抗人IgG一抗2ml(1:1000)，4℃放置12h以上；阴性对照，以1％BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同；弃一抗和 1％BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次；加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，平稳摇动，室温2h；弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次；

显色：加入显色液，暗室中制备胶片；

图4显示了不同能量LED黄光对黑素合成重要蛋白酪氨酸酶表达量的检测结果，其中，A为RT-PCR测酪氨酸酶mRNA的表达量，B为westen-blot测得酪氨酸酶蛋白的表达，根据条带颜色深浅可知，LED黄光20J/cm²照射后黑素细胞内酪氨酸酶表达量明显下降；

实验结果表明：波长为585±5nm，能量范围在20J/cm²以内的LED黄光，连续照射黑素细胞后，能抑制黑素小体成熟，使黑素细胞内III-IV期成熟色素颗粒减少，抑制黑素合成相关基因及蛋白的表达，抑制黑素细胞内酪氨酸酶活性，减少黑素含量，同时不影响黑素细胞的增殖凋亡，安全有效。

实施例2临床实验

选取黄褐斑病史1年中年女性患者，给予LED黄光(585±5nm)，20J/cm²，每周一次照射，连续干预治疗10周后，该患者双侧面颊处黄褐斑明显好转，取得了良好的疗效，提示了本发明方法有助于用于制订黄褐斑等色素沉着性疾病的干预措施。