本发明属于生物技术领域，具体涉及一种活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的低温等离子体诱导方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是威胁人类健康的四大食源性病原菌之一，它能够产生不被高温破坏的肠毒素，从而引起人体健康危害。在食品中，易被金黄色葡萄球菌污染的食品主要有鱼、肉、蛋、乳及其制品，尤其是乳品的安全常受到金黄色葡萄球菌的威胁，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件每年都会发生，是一个世界性的卫生问题。并且研究发现，在乳品在实际的生产与流通过程中，由于技术上的缺陷、人为的操作不当以及外界不利环境的胁迫等因素，常导致金黄色葡萄球形成活的不可以培养状态。但是，常规的平板培养方法并不能检测出活的不可培养状态菌，但其在产品贮藏、运输等过程中仍然具有生命体征和代谢活性，且处于活的不可培养状态的金黄色葡萄菌处于适宜的环境条件下，能够恢复到正常的状态，因此被活的不可培养状态金黄色葡萄球菌污染的食品一旦进入人体便会存在潜在危害，给食品安全保障带来严重隐患。
开展活的不可培养状态的金黄色葡萄球菌形成机制、复苏机制、检测方法等方面的研究，对于食品安全控制技术和快速简便检测方法的开发具有重要的意义。然而现有的研究结果表明，获得较大比例活的不可培养状态的金黄色葡萄球菌细菌需要比较长的时间，过程耗能高，容易对环境造成负担。因此，开发一种活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的低温等离子体诱导方法对于促进节能降耗、推动该状态细菌的研究起到重要的作用。
技术实现要素：
本发明提供活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的低温等离子体诱导方法。本发明将金黄色葡萄球菌经介质阻挡放电低温等离子体处理，使其在短时间内形成活的不可培养状态。
一种活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的诱导方法，包括如下步骤：
将金黄色葡萄球菌制成细菌悬浮液，经介质阻挡放电低温等离子体处理，形成活的不可培养状态，介质阻挡放电低温等离子体处理的条件为：处理频率为8～15kHz,，处理气隙间距为1～3mm，处理功率为25～50W，处理时间为3～5s，处理温度为室温。
本发明提供的方法，是将金黄色葡萄球菌经介质阻挡放电低温等离子体处理，诱导其形成活的不可培养状态。本发明的实验证明，利用介质阻挡放电低温等离子体技术处理金黄色葡萄球菌，可促使其在4s快速形成活的不可培养状态；本发明的方法使金黄色葡萄球菌形成活的不可培养状态的诱导时间大大缩短，有利于促进节能降耗，并对进一步推动活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的研究具有重要的意义。
优选地，所述细菌悬浮液中菌体浓度为108CFU/mL。
优选地，所述细菌悬浮液中金黄色葡萄球菌处于对数期。
优选地，所述细菌悬浮液的制备方法如下：将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923接种于普通肉汤培养基中，37℃摇床培养至对数生长期，采用质量百分含量为0.85％的无菌生理盐水洗涤对数生长期的菌体两次，重悬，使菌体浓度约为108CFU/mL即得。
优选地，低温等离子体处理时，所述细菌悬浮液置于介质阻挡放电低温等离子体杀菌装置的两极之间，以空气为放电气体。
介质阻挡放电低温等离子体处理在介质阻挡放电低温等离子体杀菌装置中进行，具体步骤为：
将细菌悬浮液装入石英培养皿(直径50mm)中，将培养皿放于两电极之间，对菌液进行低温等离子体处理，以空气为放电气体，得到诱导后菌液。
优选地，处理频率为8～12kHz，处理气隙间距为1.5～2.5mm，处理功率为25～50W，处理时间为3.5～4.5s，处理温度为20～30℃。所述气隙间距是指低温等离子体放电装置中两个电极之间的间距。
优选地，处理频率为10kHz，处理气隙间距为2mm，处理功率为25～50W，处理时间为4s，处理温度为25℃。
本发明的方法中，处理功率、处理时间、处理气隙间距等因素都会对诱导结果产生影响，在一定的范围内，随着处理功率、处理时间的增加，诱导比例逐步增加，但超过一定的比例后开始下降；而在一定范围内，随着处理气隙间距的减小，诱导比例逐步增加，但超过一定的比例后开始下降，上述优选条件为本发明的最佳处理条件，在该最佳处理条件下，各影响因素所取条件之间更好的相互协同，诱导结果最好，能在最短的时间(4s左右)内诱导出较大比例的活的不可培养菌，达到降低成本的作用。
一般一台低温等离子体设备会有一个固定的最佳频率，因此处理频率一般不会改变，相对更重要的参数是处理功率、处理气隙间距、处理时间。
超出本发明所选参数范围可能存在拮抗作用，导致诱导结果下降，本发明对比了处理时间8s、处理功率50w、气隙间距2mm：经介质阻挡放电低温等离子体处理后活菌的比例为89.89％；可培养菌的比例为18.23％；形成活的不可培养状态金黄色葡萄球菌比例为41.66％。对照组的活菌比例与可培养菌比例仍约为100％，基本认为没有活的不可培养状态的菌。与本发明实施例2相比，处理时间增加，诱导比例反而大幅降低，说明处理时间不在本发明处理时间范围内时无法完成本发明的目的。
本发明还对比了处理时间4s、处理功率50w、气隙间距4mm：经介质阻挡放电低温等离子体处理后活菌的比例为94.67％；可培养菌的比例为57.08％；形成活的不可培养状态金黄色葡萄球菌比例为37.59％。对照组的活菌比例与可培养菌比例仍约为100％，基本认为没有活的不可培养状态的菌。与本发明实施例2相比，气隙间距增大，诱导比例大幅降低，气隙间距超出本发明要求范围也无法达到本发明的诱导效果。
本发明的方法在介质阻挡放电低温等离子体处理后，还包括以下步骤：检测经过介质阻挡放电低温等离子体诱导后的金黄色葡萄球菌的活菌比例和可培养菌比例；其中，检测经过介质阻挡放电低温等离子体诱导后的金黄色葡萄球菌活菌比例采用PI/cFDA双染法，检测经过诱导处理后的金黄色葡萄球菌可培养菌比例采用平板计数法。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的实验证明，本发明开发了一种活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的低温等离子体诱导方法，利用介质阻挡放电低温等离子体技术处理细菌，可促使细菌在4s快速形成活的不可培养状态，而常用的低温寡营养的条件需要一个月以上的诱导时间；本发明的方法使金黄色葡萄球菌形成活的不可培养状态的诱导时间大大缩短，有利于促进节能降耗，并对进一步推动活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的研究具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的快速诱导
一细菌悬浮液制备
将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923接种于普通肉汤培养基中，37℃摇床培养至对数生长期。采用0.85％(质量百分含量)无菌生理盐水洗涤对数生长期的菌体两次，重悬，使菌体浓度约为108CFU/mL，作为待诱导菌液(细菌悬浮液)；
二低温等离子体处理
实验组：用介质阻挡放电低温等离子体杀菌装置(南京苏曼等离子体科技有限公司)对金黄色葡萄球菌悬浮液进行处理，具体步骤：将3mL细菌悬浮液装入石英培养皿(直径50mm)中，将培养皿放于两电极之间，对菌液进行低温等离子体处理，处理频率为10kHz，处理功率为25W,处理气隙间距为2mm，处理时间为4s，处理温度为室温，以空气为放电气体，得到诱导后菌液。
对照组：待诱导菌液不进行低温等离子体处理，只在室温中放置4s。
三检测
(1)活菌数测定方法
采用PI/cFDA双染法：具体步骤：实验组和对照组的金黄色葡萄球菌与30mmol/L的PI在冰浴中孵育10min，然后与50mmol/L的cFDA在37℃孵育10min，4℃、6000×g离心10min，用无菌生理盐水洗涤去除过量的染料，孵育完成后用流式细胞仪进行分析，每个样品收集20000个细菌检测。
(2)可培养菌数测定方法
采用平板计数法：具体步骤：参照GB 4789.2-2010方法，将诱导后菌液用0.85％无菌生理盐水进行梯度稀释，取稀释样1mL于灭菌平皿中，倒入约20mL PCA培养基摇匀，待培养基凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h，然后记录菌落数。
(3)活的不可培养状态细菌
采用上述的方法分别测定实验组和对照组的活菌比例和可培养菌比例，从而计算活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的比例(活菌比例—可培养菌比例)。
结果如下：经介质阻挡放电低温等离子体处理后活菌的比例为97.33％；可培养菌的比例为48.89％；形成活的不可培养状态金黄色葡萄球菌比例为48.44％。对照组的活菌比例与可培养菌比例约为100％，基本认为没有活的不可培养状态的菌。由此可见，本发明的方法在25W的条件下诱导4s时获得了一定比例的活的不可培养状态的金黄色葡萄球菌。
实施例2快速诱导较大比例金黄色葡萄球菌形成活的不可培养状态
一细菌悬浮液制备
与实施例1中的步骤一方法相同。
二低温等离子体诱导
与实施例1中的步骤二的方法基本相同，仅将处理功率变50W后得到诱导后菌液。
三检测
与实施例1中的三的方法相同。
结果如下：经介质阻挡放电低温等离子体处理后活菌的比例为95.72％；可培养菌的比例为23.17％；形成活的不可培养状态金黄色葡萄球菌比例为72.55％。对照组的活菌比例与可培养菌比例仍约为100％，基本认为没有活的不可培养状态的菌。由此可见，本发明的方法在50W的条件下诱导4s时获得了较大比例的活的不可培养状态的金黄色葡萄球菌。
本实施例同实施例1相比，形成的活的不可培养状态的金黄色葡萄球菌的比例更大。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。