人参防病促生细菌TY15‑2及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，确切地说是人参防病促生细菌TY15-2及其应用。

背景技术：

生物防治具有持效期长、防病促生多功能、无残留、环境友好等优点，对于有效防治根部病害具有较大的发展潜力。发展生物防治的前提是获得具有高效生物活性功能的有益微生物，其中植物内生菌是一类定殖在植物体内与植物建立和谐关系的一类微生物，有些菌株具有拮抗、促生等生物学功能，可产生多种生物活性物质，特别是在新的植物抗病虫害物质方面，为我们提供了一类新的微生物资源。而有益的根际细菌又被称为促生根际细菌(简称PGPR)，指与根有密切关系并强定殖于根系，能促进植物生长的根际细菌。目前已有多种植物的功能内生菌和根际细菌的报道。

人参是我国名贵中药材，具有悠久的药用历史，2012年，人参（人工种植）被国家卫生部批准为新资源食品，消费量和市场需求量极具增加，人参制品经济效益提高，人工栽培规模也随之增加。在人参种植过程中，病害的发生和发展对产量和品质造成严重的影响，有效控制病害是人参生产中的重要环节。目前，防治病害的主要方法是利用化学农药在病害发生期进行控制，但对于人参锈腐病等多年生地下根部病害防治效果并不理想，且长期使用化学农药或不合理使用还会导致人参农药残留超标、品质下降、污染环境和病原菌产生抗药性等系列问题。因此，开展人参生物防治研究，分离筛选获得促进植物生长且具有生物防治作用的微生物并加以应用，减少和替代化学农药的使用，对于保障我国人参生产安全，加快人参产业可持续发展进程，提高我国人参产品的质量及国际市场竞争力具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是为了减少化肥使用，而提供一种对人参生长具有促进功能的人参拮抗菌株，人参防病促生细菌TY15-2。

成团泛菌株TY15-2，保藏编号为CCTCC NO: M 2015669。

成团泛菌株TY15-2在抑制人参锈腐病菌（Cylindrocarpon destructans）、人参灰霉病菌（Botrytis cinerea）、人参菌核病菌（Sclerotinia schinseng）、人参疫霉菌（Phytophthora cactorum）、人参黑斑病菌（Alternaria panax）、人参根腐菌（Fusarium solani）、人参立枯菌（Rhizoctonia solani）方面的应用。

成团泛菌株TY15-2在促进人参根生长方面的应用。

本发明提供了一株具有固氮、解钾、产生长素和产铁载体特性，并对人参生长具有促进作用的细菌菌株TY15-2。经鉴定为成团泛菌（P. agglomerans）。它具有固氮潜能，解钾可达到7.6 µg/mL，它产IAA能力强，可达到6.25µg/mL，有产生铁载体的能力，其活性达84.6%。对人参苗期病害的防治及成株期锈腐病的防治具有较好效果；对人参根生长具有明显促进作用，鲜重增加10.64%；该菌的发现为人参生物防治研究与应用，提供良好的基础。

附图说明

图1 TY15-2菌株的拮抗试验（A：人参锈腐病菌，B：人参菌核病菌，C:人参疫霉菌，D:人参根腐菌）；

图2 TY15-2菌株在NA培养基上的菌落形态；

图3 TY15-2菌株电镜下观察的菌体形态；

图4 TY15-2菌株的分子鉴定聚类图谱；

图5 TY15-2菌株促生功能分析（A：固氮能力，B：解钾特性，C:产生IAA，D:产铁载体）

图6 TY15-2菌株对人参成株期锈腐病的田间防治效果（A：TY15-2菌株，B：清水对照，C:噻咯霜灵，D:益微菌剂）；

图7 TY15-2菌株对人参根的促生作用（左：清水对照，右：TY15-2菌株）。

具体实施方式

实施例1 菌株TY15-2的筛选

健康人参根2015年10月采集于吉林省通化市。人参拮抗菌株的筛选分为初筛和复筛。初筛采用混菌法对分离得到的120株内生细菌和178株根际细菌进行菌体抑菌活性的筛选，将1ml无菌水分别加入人参锈腐病菌（Cylindrocarpon destructans）、人参灰霉病菌（Botrytis cinerea）、人参菌核病菌（Sclerotinia schinseng）、人参疫霉菌（Phytophthora cactorum）、人参黑斑病菌（Alternaria panax）、人参根腐菌（Fusarium solani）、人参立枯菌（Rhizoctonia solani）7种人参病原菌的PDA培养试管中，用接种针将菌丝及孢子刮下，分别制成菌悬液与PDA培养基混合后倒入培养皿中制成含菌平板，将内生和根际细菌的菌碟放入混好靶标菌的平板内，25℃培养3-5d后根据抑菌圈直径的大小筛选出抑菌活性好的菌株。复筛采用牛津杯对初筛得到的活性菌株进行筛选，将初筛得到的活性菌株分别接种于LB液体培养基中，振荡培养12h制成种子液，按6%的接种量，将种子液接入发酵培养基中（葡萄糖20g/L、淀粉15g/L、酵母浸粉5g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、NaCl 5g/L），培养时间3d；培养完成后取发酵液12,000r/min、4℃离心20min，取上清液用孔径0.22µm的过滤器过滤得无菌发酵液。将牛津杯放在在混好病原菌的PDA平板上打孔，然后加入无菌发酵液200µL，置25℃培养3-5d后采用十字交叉法测量抑菌圈直径。通过初筛和复筛试验，最终获得一株对人参7种病原菌具有较好抑菌效果的菌株TY15-2，如图1所示。

实施例2菌株TY15-2的鉴定

将TY15-2菌株划线在NA培养基上，28℃培养观察菌株TY15-2在NA培养基上呈淡黄色不透明圆形小菌落，边缘整齐，如图2所示。

取在NA培养基中培养的TY15-2菌株进行负染色制备样品，在透射电镜下观察发现菌体呈杆状，具有周生鞭毛，如图3所示。

参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基（表1）和方法测定TY15-2菌株的生理生化特性发现，菌株TY15-2为革兰氏染色阴性菌；接触酶、氧化酶、V-P反应为阳性；能利用柠檬酸、丙二酸，使硝酸盐还原；但不能使淀粉水解，可使明胶液化；石蕊牛奶试验产碱，对NaCl 的耐受性为7%；可以利用葡萄糖、甘露醇、半乳糖和果糖。

获得菌株16S rDNA序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对，获得登录号为KX951467，与Pantoea agglomerans strain SSF（KT075194）和strain WSE（ KT075212）相似度达到99.80%；构建系统进化树，如图4所示，TY15-2与P. agglomerans 聚于同一分支中。通过形态特征、培养特征、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，TY15-2菌株为成团泛菌（P. agglomerans TY15-2）。成团泛菌TY15-2，已于2015年11月9日，保存于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072，编号为CCTCC NO: M 2015669。

实施例3 菌株TY15-2促生特性的测定

1. 固氮能力的测定

将菌株TY15-2划线接种于Ashby固体培养基上，30℃培养观察菌株长势，结果发现菌株TY15-2在无氮条件下长势良好，具有固氮潜能，如图5所示。

2. 解钾能力的测定

将菌株TY15-2接种于硅酸盐固体培养基上，30℃培养观察解钾圈大小，如图5所示，菌株TY15-2具有明显的解钾圈；再采用火焰光度法，将菌株TY15-2接种到LB培养基上，培养12h后测定吸光值。用火焰光度计定量测量其解钾含量可达到7.6 µg/mL。

3. 产IAA能力的测定

将菌株TY15-2接种到液体LB培养基中培养12h。将菌液在工作台操作下稀释到吸光值0.8左右。取0.2ml接种到含100mg/L色氨酸培养基中培养，然后12000rpm离心5min，取上清液2ml加入显色液4ml，暗处放置0.5h 后在540nm下测定吸光值，如图5所示。经测定菌株TY15-2产IAA能力可达到6.25µg/mL。

4. 产铁载体能力的测定

用接种环挑取一环新鲜菌苔于MKB培养液内摇床培养2d，取菌液10000r/min离心10min得上清3ml于试管中，加入3ml CAS检测液混匀后20℃反应1h，在630nm处测定吸光值As；另取3ml CAS检测液与3ml未接菌的MKB培养基混匀，同样测吸光值Ar，如图5所示。根据公式（(Ar－As) /Ar)× 100）计算铁载体产生量。结果显示，TY15-2菌株具有产生铁载体活性，其活性高达84.6%。

实施例4菌株TY15-2对人参苗期病害的防治试验

试验于2015年4月28日，在吉林省通化市柳河县向阳镇人参种植基地，将浓度为10⁶cfu/mL的人参锈腐病菌孢子菌丝混合液，与灭菌土壤混合制成菌土，供接种使用。选用大小均匀、无病无伤、裂口率90%以上的参籽用1％的次氯酸钠和75％乙醇进行消毒，将消毒后的种子用浓度为10⁸cfu/mL的TY15-2菌株菌悬液浸泡1h，捞出晾干后播种，小区面积1m²，每小区播种150~200粒，3次重复；以清水处理、浓度为20g/10kg栽子的300亿/克益微可湿性粉剂（京青仲信（北京）科技有限公司）和浓度为60g/10kg栽子的25%噻虫·咯·霜灵悬浮种衣剂（先正达（中国）投资有限公司）为对照；播种后用菌液浇灌土壤，根据土壤需水情况，7~10d浇灌1次，共浇灌2次。10~15d后，记录每个处理的出苗率，6月初和7月初分别调查苗期病害的发病率和保苗率，计算防治效果，防治效果 (%) = (对照发病率–处理发病率)/(对照发病率) × 100。

通过菌株TY15-2对人参苗期病害的田间防治试验，由表2可知，菌株TY15-2处理人参苗发病率为13.55%，高于化学农药25%噻虫·咯·霜灵FS处理的7.82%，与300亿/克益微菌剂处理的15.35％相当，但明显低于清水对照的51.40%。菌株TY15-2对人参苗期病害的防治效果为73.63%，低于25%噻虫•咯•霜灵FS对照的84.78%，但与300亿/克益微菌剂对照的70.14%相当。结果表明菌株TY15-2对人参苗期病害具有较好的防治效果和应用前景。

实施例5：菌株TY15-2对人参成株期锈腐病的防治试验

菌株TY15-2对人参成株期锈腐病的田间防治试验于2015年4月28日在吉林省通化市柳河县向阳镇人参种植基地进行。土壤接种锈腐病菌方法同上，选用2年生的人参栽苗，用0.1%次氯酸钠和70%乙醇进行消毒，用无菌水冲洗2遍，晾干后置于浓度为10⁸cfu/mL的TY15-2菌株菌悬液中浸泡1h，捞出晾干后即可栽种，每小区30株，行距20cm，每行15株，小区间保护间隔20cm。以清水处理、浓度为20g/10kg栽子的300亿/克益微WP和60g/10kg栽子的25%噻虫·咯·霜灵FS为对照；人参栽种后用10⁸cfu/mL的TY15-2菌株菌悬液进行浇灌，以浓度为1800g/公顷的300亿/克益微WP为对照，每行人参浇灌500mL菌悬液，7~10d后再浇灌1次，共浇灌2次；待到秋天人参做货时，对病害发生情况进行严重度分级调查，并计算防治效果。人参锈腐病严重度分级标准如下：0级：无可见病斑；1级：病斑褐色，直径小于等于0.9 mm；2级：病斑深褐色，直径1.0~4.0mm；3级：病斑黑色，直径4.0~7.0mm；4级：病斑黑色，直径大于7.0mm，病斑相连；5级：整个根部腐烂。病情指数（disease severity index，DSI）= ([X0× 0] + [X1× 1] + [X2× 2] + [X3× 3] + [X4× 4] + [X5× 5])/( X0+ X1 + X2 + X3 + X4 + X5)，X0，X1，X2，X3，X4和X5分别代表0~5级的病株数。防治效果 (%) = (对照病情指数–处理病情指数)/(对照病情指数) × 100。

通过菌株TY15-2对人参成株期锈腐病的田间防治试验，结果由表3和图6可知，生防菌株TY15-2的平均防效为68.02%，与300亿/克益微WP处理的防效（68.94%）相当，低于化学药剂25%噻咯霜灵FS处理的防治效果（77.27%）。从结果可以看出，生防菌株TY15-2对人参成株期锈腐病具有较好的防治效果，为生防菌剂防治人参锈腐病菌的应用提供科学。

实施例6：菌株TY15-2对人参的促生试验

田间试验地点选在吉林省通化市柳河县向阳镇人参种植基地进行。2015年4月28日，将大小均匀的2年生人参栽子种植于肥力一致的人参床中，种植深度为5cm。6月6日，人参出苗完全展叶后，采用灌根法将无菌水洗涤悬浮后浓度为10⁸ cfu/mL的TY15-2菌悬液施用于根部。每重复处理60株（4行）人参，共4次重复，每行人参（15株）浇灌500mL菌悬液，以清水为对照，每隔15d浇灌一次，共浇灌3次。2015年10月25日人参地上部茎叶脱落后，每个处理挑选小区中间两行（30株）人参为一个单位，测定根鲜重和干重，与清水对照进行比较。试验结果表明，TY15-2菌株对人参根生长具有明显的促进作用，经TY15-2菌株处理的人参与清水对照相比，鲜重增加10.64%，统计结果详见表4、图7。