一株产γ‑氨基丁酸的植物乳杆菌SG5的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，更具体地，涉及一种产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌SG5。

背景技术：

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)是哺乳动物神经中枢的一种抑制性递质，具有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、促进乙醇代谢(醒酒)等多种功效。2009年卫生部已正式批准GABA为新资源食品，富集GABA的原料可应用于生产功能性食品，通过饮食来降低和预防高血压。GABA的获取方法有化学合成法和生物法。化学合成法成本较高，产品中易残留化学物质，不属于天然产物，应用有条件限制。生物法主要从植物体和微生物发酵液中获取，相对于植物富集法的成本高、产率低和局限性大的缺点，微生物发酵法更有优越性，它不受空间、环境和资源的限制，具有成本低、无化学残留和产量高等显著优点，是富集γ-氨基丁酸的理想途径。

现有技术分离得到的产γ-氨基丁酸的微生物多为真菌，真菌生长较为缓慢，不能满足生产需要。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种γ-氨基丁酸的植物乳杆菌SG5。

本发明第二个目的是提供含有所述植物乳杆菌SG5的微生物制剂。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌SG5，该植物乳杆菌SG5保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期为2016年3月16日，保藏编号为GDMCC No：60020。

菌株菌落形态鉴定：在MRS培养基上菌落较小、圆形、中间隆起，表面湿润光滑，不透明，乳白色，边缘整齐；革兰氏阳性菌，成对或链状。菌株形态呈两端钝圆的短杆状，长短不一，无芽孢，细胞大小为(0.5～1)μm×(2～3)μm，该菌株为兼性厌氧菌，API50鉴定结果与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的ID为99.9％。

所述植物乳杆菌SG5的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明植物乳杆菌SG5可在MRS培养基上生长，其中培养基的最佳配方为20g/L酵母膏、20g/L葡萄糖、10g/L丁二酸钠、5mg/mL L-谷氨酸、1mg/L磷酸吡哆醛及1mg/mL Ca²⁺。

植物乳杆菌SG5的最适生长温度30℃，最适合生长环境的pH值为6.8；可高产γ-氨基丁酸的最佳发酵时间为48h，菌体接种量为2％。

γ-氨基丁酸作为新型功能因子，具有降低血压的作用，因此，本发明还提供一种含有所述植物乳杆菌SG5的微生物制剂。

本发明还提供所述植物乳杆菌SG5在产γ-氨基丁酸方面的应用。

具体地，所述应用是将植物乳杆菌SG5在TYG培养基中，30℃培养48h，pH值为6.8，所述植物乳杆菌SG5的接种量为2％(×10⁶cfu/mL)。

更具体地，所述TYG培养基的组成为每升培养基中含有20g/L酵母膏、20g/L葡萄糖、10g/L丁二酸钠、5mg/mL L-谷氨酸、1mg/L磷酸吡哆醛及1mg/mL Ca²⁺。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌SG5，该植物乳杆菌SG5保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期为2016年3月16日，保藏编号为GDMCC No：60020；利用该菌进行发酵GABA的含量可达59μg/mL，GABA具有降血压、促进生长激素分泌和降低胆固醇等多种有益的保健功能，为开发新的富含γ-氨基丁酸的保健食品提供依据，将所述植物乳杆菌SG5应用于食品、保健品的开发，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为基于16SrDNA基因序列建立的乳杆菌属系统发育树。

图2为发酵液超高效液相色谱-质谱图；其中，A—GABA标准品的峰图；B—GABA标准品分子质量图谱；C—发酵液样品超高效液相色谱图；D—发酵液样品的分子质量图谱。

图3为SG5在MRS培养基(A)及乳酸菌分离培养基(含溴甲酚绿)平板(B)上的菌落形态图。

图4为菌株SG5革兰氏染色的细胞形态。

图5为SG5菌体投射电镜图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1菌株的分离、筛选与鉴定

菌株分离：选取新鲜完整的桑叶先用自来水冲洗干净，在无菌超净台内用无菌水再冲洗及用无菌滤纸吸干水分，剪碎；将剪碎的桑叶置于MRSG液体培养基(MRS培养基中加入2％v/v，1mg/mL的谷氨酸钠)中，于30℃恒温培养箱培养2d，待桑叶碎片周围长出菌体，挑取菌体在MRS固体培养基上多次划线分离纯化；将纯化后的菌株于斜面培养基(MRS)培养，挑单菌落接种于发酵培养基TYG中30℃培养48h后做薄层定性，初步鉴定分离可知所得菌株可产γ-氨基丁酸。

阴性对照：为了检查桑叶表面除菌是否彻底，取最后一次无菌水冲洗液涂布在MRS固体培养基上作对照，另将无菌水清洗后的桑叶材料在MRS固体培养基上作对照，于相同的条件下培养。

经过多次重复，对照的平板培养基均无任何菌落长出，证明桑叶表面除菌彻底，分离到的菌是桑叶内细菌，而不是植株表面的附生菌。

菌株的筛选：以功能活性物质—γ-氨基丁酸为指标，采用响应面分析法优化菌株发酵条件。将-80℃保存的分离所得菌株于MRS液体培养基中30℃，120r/min培养16h，活化两次，接种于TYG发酵培养基中富集GABA。根据单因素实验结果对4个主要因素(底物浓度、发酵温度、发酵时间)进行响应面优化实验，建立实验模型，若实验模型显著，利用响应面优化试验方法，最终设计三因素三水平的响应面实验，以底物浓度、发酵温度和发酵时间3个因素为自变量，GABA产量为响应值，确定最优发酵条件。用Berthelot比色法或HPLC法对发酵液中富集的GABA定量分析，最终确定高产GABA菌株(简称为SG)。

菌株分子鉴定：对筛选得到的高产GABA菌株进行分子鉴定，按以下步骤进行：提取菌株的基因组DNA，利用细菌16S rDNA的通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆的菌落，经扩大培养后委托广州华大基因技术有限公司进行测序。

测序可知菌株的16S rDNA序列长度为1371bp，其序列如SEQ ID NO：1所示，将测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件构建系统发育树(如图1所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与Lactobacillus plantarum(植物乳杆菌)的同源性达99％，因此将该高产GABA的菌株属于乳杆菌属(Lactobacillus)，为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

菌株菌落形态鉴定：在MRS培养基上菌落较小、圆形、中间隆起，表面湿润光滑，不透明，乳白色，边缘整齐；在乳酸菌分离培养基(含溴甲酚绿)平板，30℃培养48h，出现圆形乳白或黄色菌落，周围培养基变为黄色者初步确定为乳酸菌(如图3所示)。菌体形态经革兰氏染色后用显微镜于100倍的油镜下观察并拍照。如图4所示，可知其为革兰氏阳性菌，成对或链状。菌株细胞经透射电镜(TEM,Tenai 12,Holland)观察，见图5，形态呈两端钝圆的短杆状，长短不一，无芽孢，细胞大小为(0.5～1)μm×(2～3)μm。

菌落生理生化鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册》(第九版)、《常见细菌系统鉴定手册》和法国生物梅里埃API鉴定系统对植物乳杆菌进行鉴定，其结果如表1所示：

表1菌株SG-5的API 50CHL检测结果

注：“﹣”表示阴性，“﹢”表示阳性。

由表1结果再次验证，植物乳杆菌SG5API的ID与Lactobacillus plantarum(植物乳杆菌)为99％，将其命名为该植物乳杆菌SG5，该植物乳杆菌SG5保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址是广东省微生物研究所，保藏日期为2016年3月16日，保藏编号为GDMCC No：60020。

实施例2菌株的培养

植物乳杆菌SG5可在MRS培养基上生长，MRS培养基(1000mL)由20g酵母膏、20g葡萄糖、10g丁二酸钠、5mg/mL L-谷氨酸(0.5％v/v)、1mg磷酸吡哆醛(生长因子)及1mg/mL Ca²⁺和余量的蒸馏水组成，调节pH值6.8～7.0，于121℃高压灭菌20min。

1、植物乳杆菌SG5的活化：在超净工作台中无菌操作。用接种环挑取植物乳杆菌SG5，在MRS固体培养基上用接种环划线，在30℃培养箱中进行培养2d。

2、植物乳杆菌SG5发酵样品的制备：将分离得到的植物乳杆菌SG5接种于MRS液体培养基中，作3个重复，置于150r/min，30℃恒温振荡培养箱中，培养16～18h取出，作为种子液；将种子液按2％的接种量接种到装有50mL TYG液体培养基的三角瓶中，置于150r/min 30℃恒温振荡培养箱中培养2d，得发酵液(经优化得植物乳杆菌SG5的最适生长温度为30℃，最适生长环境的pH值为6.8)。

3、用超高效液相-质谱联用法对发酵液样品中GABA进行定性及定量的检测：GABA标准品购至Sigma公司，乳酸菌发酵液样品的超高效液相色谱-质谱分析图与标准品GABA相比较见图2。

由图2可以看出标准品GABA的出峰时间在0.4～0.6min，其相对分子质量为104.0707；检测发酵液样品GABA相对分子质量为104.1072，与标准品GABA的相对分子质量十分接近，发酵液样品的出峰时间较标样的略宽些，还有一个小的杂峰出现，有可能是受到其他基质的干扰。该结果证实了发酵液中含有GABA。

4、高效液相色谱法(HPLC)测定发酵液GABA含量

将SG5的发酵液沸水浴10min后，以12000r/min离心10min，用微量进样器吸取上清液用高效液相色谱法(HPLC)法分别测定初筛的五个样品发酵液中γ-氨基丁酸的浓度(优化得植物乳杆菌SG5产γ-氨基丁酸的最佳液体发酵时间为48h，GABA的含量可达59μg/mL)。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一株产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌SG5

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1371

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌SG5的16S rDNA序列

<400> 1

gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 60

gcgattccga cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc cgaactgaga atggctttaa 120

gagattagct tactctcgcg agttcgcaac tcgttgtacc atccattgta gcacgtgtgt 180

agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 240

ccggcagtct caccagagtg cccaacttaa tgctggcaac tgataataag ggttgcgctc 300

gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 360

atccatgtcc ccgaagggaa cgtctaatct cttagatttg catagtatgt caagacctgg 420

taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 480

tcaattcctt tgagtttcag ccttgcggcc gtactcccca ggcggaatgc ttaatgcgtt 540

agctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc attcatcgtt tacggtatgg 600

actaccaggg tatctaatcc tgtttgctac ccatactttc gagcctcagc gtcagttaca 660

gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt tcaccgctac 720

acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc agtttccgat gcacttcttc 780

ggttgagccg aaggctttca catcagactt aaaaaaccgc ctgcgctcgc tttacgccca 840

ataaatccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 900

gtggctttct ggttaaatac cgtcaatacc tgaacagtta ctctcagata tgttcttctt 960

taacaacaga gttttacgag ccgaaaccct tcttcactca cgcggcgttg ctccatcaga 1020

ctttcgtcca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct 1080

cagtcccaat gtggccgatt accctctcag gtcggctacg tatcattgcc atggtgagcc 1140

gttaccccac catctagcta atacgccgcg ggaccatcca aaagtgatag ccgaagccat 1200

ctttcaagct cggaccatgc ggtccaagtt gttatgcggt attagcatct gtttccaggt 1260

gttatccccc gcttctgggc aggtttccca cgtgttactc accagttcgc cactcagtca 1320

aatgtaaatc atgatgcaag caccaatcaa taccagagtt cgttcgactg c 1371