一种急性肝胰腺坏死综合症中priA基因的LAMP试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及微生物检测
技术领域：
，具体说是涉及一种快速并且可实时定量检测急性肝胰腺坏死综合症中priA基因的LAMP试剂盒及其应用。
背景技术：
：急性肝胰腺坏死综合症(AcuteHepatopancreasNecrosisSyndrome，AHPNS)主要引起仔虾和幼虾阶段的患病对虾大量死亡，死亡对虾的肝胰腺呈现明显的病变为特征，为当前危害我国对虾产业的严重病害。该病于2009年在越南暴发，随后相继在马来西亚和泰国暴发流行。因与越南等国比邻且多有对虾交易往来，我国于2010年开始在沿海养殖区域发现AHPNS流行，海南、福建、广东和广西部分地区对虾的死亡率高达80％。据统计，2013年全球养殖对虾产量较2012年减少23％，而我国的虾产量则下降约17％，估计每年给我国对虾产业造成的直接经济损失超过10亿元人民币。除大规模减产外，该病还带来诸多负面影响，例如：对虾养殖人员就业问题、对虾供求问题和全球对虾市场价格问题等。可见，AHPNS已对东南亚国家乃至全球的对虾养殖及相关产业造成了前所未有的打击和经济损失。对急性肝胰腺坏死综合症病原的确定，各国科学家众说纷纭，观点不一，但各方都没能拿出令“其它观点支持者”信服的证据，对该病的研究更多是建立在猜测和设想的基础上。中国虾产业体系首席科学家何建国认为导致对虾发病死亡之快的原因可能有两方面，即副溶血性弧菌致病和不明原因的中毒。中国虾产业体系北方区病害防控岗位科学家黄倢则认为AHPNS的暴发可能与黄头病毒(YHV)的新型变异病毒株的感染相关，美国Lightner教授认为其病原为副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的特异菌株。最近罗竹芳教授及其团队认为AHPNS的暴发可能与致病性质粒所携带的PriA和PriB毒素蛋白密切相关，他们在Lightner教授的研究基础上发现了PVA-1质粒的自杀基因机制，发现PVA-1质粒中除了有PriA和PriB两种毒素基因以外，还有自杀毒素基因(pndA)和自杀解毒基因(pndB)。pndA的mRNA半衰期为20min，而pndB的mRNA仅有30sec。当把PVA-1质粒从弧菌细胞内移除后，细胞质内残余的pndAmRNA继续翻译出自杀毒素，而pndB的mRNA则尚未翻译出足够的解毒蛋白，使得自杀毒素累积，造成弧菌死亡。他们发现PriA和PriB毒素基因可诱导AHPNS症状，其中PriB毒力较PriA强，同时还发现两个基因操纵子位于不稳定的序列上，且可能在其他微生物间自由进出。后续研究表明PriA和PriB毒素蛋白的三维结构与苏云金芽孢杆菌分泌的一种昆虫毒素蛋白非常相似，暗示苏云金芽孢杆菌也可能引起对虾肝胰腺的坏死。另外，研究还发现P.asymbiotica中PriA和PriB之间的DNA序列含有一段肠杆菌基因键重复序列(ERIC)，该序列与mRNA的稳定性和表达密切相关，提示通过基因工程技术对该序列进行干预，将有可能破坏PriA和PriB之间的相互作用或表达的稳定性，从而实现“去毒”的可能，这或许可在因受PriA和PriB毒素蛋白作用而中毒的对虾解毒策略上提供借鉴。解旋酶活性与复制叉底物结合活性的相互作用，决定了PriA是进行复制体装载还是模板解螺。由此可见，如果此两种毒素基因能自由出入其他微生物，致病性质粒所携带的毒素基因是AHPNS的致病原因的科学假说无疑对深入研究该病带来了希望。PriA是一种3'5'解旋酶,是SF2解旋酶超级家族中一员，这个蛋白由三个重要的功能域组成：N一末端DNA结合域,DNA解旋酶域，以及嵌在解旋酶域中的锌指序列。研究已发现了PriA与DNA稳定结合的两种形式。一种是PriA与双链DNA上的一段单链结合，这反映了PriA的解旋酶活性。另一种是PriA与三链交叉处结合,反映了PriA的D-loop结合活性。由于缺乏对病原的认识，目前未能制定出合理有效的防制措施。因此，检测急性肝胰腺坏死综合症中priA基因对该病的致病因素及其传播途径以及与机体的相应作用进行研究就显得十分必要。目前，急性肝胰腺坏死综合症检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。常规方法是通过对细菌的表型特征和生化指标进行鉴定。鉴定急性肝胰腺坏死综合症的生化指标主要包括：革兰氏染色、氧化酶实验、过氧化氧酶实验、CAMP实验、V-P反应(福格斯-普利斯考尔)产物实验、凝集实验、ELISA实验等。但常规鉴定方法存在操作复杂,所需时间长以及特异性不强的缺点。另外，也建立了急性肝胰腺坏死综合症的特异性副溶血性弧菌的PCR方法检测方法。虽然PCR方法较常规方法快速准确，但需要复杂的仪器设备，成本较高，不适合基层和现场检测，而且该方法不能保证与每个可能的非急性肝胰腺坏死综合症细菌的样本或者其它有机体没有交叉反应，也不能保证这种方法能检测出每一株可能引起对虾AHPND的细菌。该PCR方法只是作为一个临时检测工具。LAMP方法具有以下几个显著特点：第一、特异性高。第二、方便、快速、无需昂贵仪器。第三、高灵敏度。LAMP方法的灵敏性极高，有文献报道，只要反应体系内存在有6个拷贝的基因，反应结果便会出现阳性。第四、检测结果判定简单方便。LAMP反应结束后，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性对照管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性管底部无沉淀物；或加入荧光染料，用肉眼便可观察实验结果。总之，LAMP技术仅应用简单的实验仪器,能够满足基层、现场、即时、大批量样本检测的需要，克服了传统PCR方法的不足之处。目前尚无建立有用于检测急性肝胰腺坏死综合症中priA基因的LAMP方法，本发明的LAMP实时浊度法有别于一般的LAMP显色法，可实时监测反应过程中所产生的白色沉淀，从而实现对LAMP整个反应过程的实时监控，有效的排除非特异性扩增，增加诊断准确性。技术实现要素：本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测急性肝胰腺坏死综合症中priA基因的方法，公开一种快速、实时定量的检测急性肝胰腺坏死综合症中priA基因的LAMP试剂盒及其检测方法。为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种急性肝胰腺坏死综合症中priA基因的LAMP试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2×ReactionMix、BstDNAPolymerase、荧光目视检测试剂、DNA模板和DistilledWater，所述LAMP引物包括外引物是F3与B3和内引物是FIP与BIP；其中引物的序列分别为：F3GCCATCAATGGAATATTGGATB3GAAGACTTACAGTTGTTGCTAAFIPCAGCATAACCGAAGTTTTCGATAGTCAAAATCAAAGAGACACGCGBIPTTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGGCAATATCGCATAACCAAGC。优选的，所述的DNA模板取自通用型柱式基因组DNA。优选的，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿色荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。一种急性肝胰腺坏死综合症中priA基因的LAMP试剂盒的应用，采用该试剂盒检测PriA基因，具体检测步骤包括：(1)LAMP引物的设计与合成(2)通用型柱式基因组DNA提取(3)LAMP反应体系建立(4)LAMP检测方法。优选的，所述的LAMP反应体系建立LAMP反应体系以25μl计，优选的，所述的LAMP检测方法采用实时、定量的检测方式。优选的，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。优选的，所述的LAMP检测方法进行密闭全程监控。本发明的实质性特点和进步是：1)特异性强所检测的阴性对照株均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。2)灵敏度高普通的PCR检测方法的灵敏度为5.02×10-5ng/μL数量级，而使用本发明检测方法，检测限约为5.02×10-6ng/μL，是普通PCR的10倍左右。3)迅速得出结果普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从通用型柱式基因组DNA提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在30-40min间出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判定方式简便—扩增结束即可判断结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从质粒提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。4)不造成污染目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖。5)可实时定量本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320浊度仪来实时分析LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的PriA基因拷贝数，达到定量检测产物的目的。附图说明图1是本方明LAMP方法特异性检测结果；其中A1：PriA阳性质粒；A2：发光杆菌；A3：美人鱼发光杆菌美人鱼亚种；A4：苏云金芽孢杆菌杀虫亚种；A5：副溶血弧菌；A6：副溶血弧菌；A7：军团菌；A8：溶藻弧菌；C1：鳗弧菌；C2：酿酒酵母菌：C3：苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种；C4：空白对照(水)。结果显示PriA阳性质粒反应管出现浊度的上升曲线，10株对照菌反应管和水对照反应均无扩增。图2和图3是本发明LAMP方法及传统PCR方法的敏感性检测结果；其中A1：5.02×10ng/μL、A2：5.02×100ng/μL、A3：5.02×10-1ng/μL、A4：5.02×10-2ng/μL、A5：5.02×10-3ng/μL、A6：5.02×10-4ng/μL、A7：5.02×10-5ng/μL、A8：5.02×10-6ng/μL、A9：5.02×10-7ng/μL、A10：5.02×10-8ng/μL、A11：5.02×10-9ng/μL；重组质粒pMD18-T-PriA的起始浓度为5.02×10ng/μL，经10倍倍比稀释后进行LAMP和PCR扩增，结果显示LAMP法检测限约为5.02×10-6ng/μL，而PCR法检测限为5.02×10-5ng/μL。图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为PriA阳性质粒为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。图5是本发明急性肝胰腺坏死综合症中priB基因定量标准曲线；利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的急性肝胰腺坏死综合症中priB基因拷贝数。图6是本发明LAMP方法临床样品检测结果：A1-A5为健康虾1-5号；A6为病虾9号；C1-C8为病虾1-8号。结果显示C1、C2、C4、C6、C7、C8和A6出现浊度的上升曲线，C3、C5及A1-A5反应管均无扩增。具体实施方式1、材料的准备PriA阳性质粒、发光杆菌、美人鱼发光杆菌美人鱼亚种、苏云金芽孢杆菌杀虫亚种、副溶血弧菌、副溶血弧菌、军团菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、酿酒酵母菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种为广西壮族自治区水产研究院分离保存。LAMP法DNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号SLP204，通用型柱式基因组提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW2298。2、LAMP引物的设计与合成根据GenBank中的PriA基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，其中F3、B3为PriA基因PCR检测引物，其中F3GCCATCAATGGAATATTGGATSEQIDNO：1B3GAAGACTTACAGTTGTTGCTAASEQIDNO：2FIPCAGCATAACCGAAGTTTTCGATAGTCAAAATCAAAGAGACACGCGSEQIDNO：3BIPTTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGGCAATATCGCATAACCAAGCSEQIDNO：43、通用型柱式基因组DNA提取使用康为世纪生物科技有限公司生产的通用型柱式基因组提取试剂盒提取通用型柱式基因组DNA。4、LAMP反应体系建立按照试剂盒说明书，按25μl体系配置：LAMP反应在以实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达到0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以试剂盒推荐的63℃做为反应温度。5、LAMP检测方法1)特异性检测分别提取PriA阳性质粒、发光杆菌、美人鱼发光杆菌美人鱼亚种、苏云金芽孢杆菌杀虫亚种、副溶血弧菌、副溶血弧菌、军团菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、酿酒酵母菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种的基因组DNA作为LAMP反应的模板，同时进行各菌株的LAMP扩增，检验LAMP方法的特异性。2)敏感性检测以提取的病虾基因组DNA为模板，用外引物F3和B3进行PCR扩增，将目的基因连接载体pMD-18T，进行克隆，提取单克隆菌质粒，测定其浓度，经测序验证。用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释成10个稀释度，取各稀释度质粒2μL作为模板进行LAMP扩增和PCR扩增，对比本发明的LAMP方法和普通PCR方法对检测PriA基因的敏感性。3)荧光可视化检测根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应40分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染。实施例1LAMP检测方法的特异性结果对PriA阳性质粒、10株阴性对照菌和水对照进行LAMP扩增，结果如图1所示，PriA阳性质粒反应管在15分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，10株阴性对照菌反应管和水对照反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果。实施例2LAMP检测方法的敏感性结果重组质粒pMD18-T-PriA的起始浓度为5.02×10ng/μL，经10倍倍比稀释后进行LAMP和PCR扩增，结果如图2、图3所示，显示LAMP法检测限约为5.02×10-6ng/μL，而PCR法检测限为5.02×10-5ng/μL。实施例3LAMP检测方法的荧光可视化检测结果根据浊度仪监控优化的条件，反应器加入荧光染料，63℃反应40分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为PriA阳性质粒为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。试验结果表明本发明建立的方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃40分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。实施例4急性肝胰腺坏死综合症中priA基因定量标准曲线的绘制设置对照：浓度为5.02×101ng/μL、5.02×100ng/μL、5.02×10-1ng/μL、5.02×10-2ng/μL、5.02×10-3ng/μL、5.02×10-4ng/μL、5.02×10-5ng/μL、5.02×10-6ng/μL、5.02×10-7ng/μL、5.02×10-8ng/μL、5.02×10-9ng/μL的标准样品各一个，因为浓度的负对数值与浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间做成标准曲线，获得标准曲线方程，y＝0.3791x-7.8516如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R2为0.9965，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为21分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于0.1095，则浓度为10-0.1095，再乘以基数5.02，即为该试验样品点的浓度，从而达到定量的效果。时间(分钟)182123262931标准值(-LOG)-101234实施例5LAMP方法临床样品检测结果对随机采集的健康虾和病虾进行LAMP扩增，结果如图6所示：A1-A5健康虾及病虾C3，C5反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果；A6及C1-C2、C4、C6-C8病虾反应管出现浊度的上升曲线，为阳性结果；也即健康虾1-5检测及病虾3、5结果均为阴性，病虾1、2、4、6、7、8、9检测结果均为阳性。<110>广西壮族自治区水产科学研究所<120>一种急性肝胰腺坏死综合症中priA基因的LAMP试剂盒及其应用<160>4<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1GCCATCAATGGAATATTGGAT<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2GAAGACTTACAGTTGTTGCTAA<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>3CAGCATAACCGAAGTTTTCGATAGTCAAAATCAAAGAGACACGCG<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>4TTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGGCAATATCGCATAACCAAGC当前第1页1 2 3