食管鳞癌组织中lncRNA的荧光原位杂交检测方法与流程

本发明涉及一种食管鳞癌组织中lncRNA的荧光原位杂交检测方法。

背景技术：

LncRNA在食管鳞癌细胞株内的原位检测技术比较成熟，但食管鳞癌组织内lncRNA的荧光原位杂交技术一直不成熟。由于食管鳞癌间质内的胶原和纤维素的限制，导致荧光剂残留过多，背景染色较差，肿瘤实质染色与间质残留区分不明显。因此，食管鳞癌组织内lncRNA的荧光原位杂交检测技术有待进一步优化。

食管鳞癌组织内lncRNA的定量分析常用RT-PCR；亚细胞内定位常用方法是核质分离提取RNA，再进行RT-PCR定量分析。但是这些操作复杂，耗时耗力。

有学者利用BCIP/NBT、DAB等染料，对RNA原位杂交结果进行染色，以检测食管鳞癌组织lncRNA的表达。但是肿瘤组织内DAB染色非特异性显色明显，lncRNA杂交显色成像质量较差。尤其是对于表达丰度较低的lncRNA，BCIP/NBT染色的RNA原位杂交结果几乎呈阴性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种食管鳞癌组织中lncRNA的荧光原位杂交检测方法，用于肿瘤组织内lncRNA的表达水平及亚细胞定位检测。

为了达到上述目的，本发明提供了一种食管鳞癌组织中lncRNA的荧光原位杂交检测方法，其特征在于，包括：制备冰冻食管鳞癌组织切片，进行固定、消化与通透，采用lncRNA探针进行检测，进行DNA染色，封片，采用共聚焦显微镜检测成像或荧光显微镜检测成像。

进一步地，所述的lncRNA探针采用cy3标记。

进一步地，所述的食管鳞癌组织中lncRNA的荧光原位杂交检测方法还包括：根据lncRNA成像位置，判断lncRNA是定位于细胞核还是细胞质，还是核质均匀表达。

进一步地，所述的食管鳞癌组织中lncRNA的荧光原位杂交检测方法还包括：根据食管鳞癌组织中lncRNA成像的荧光光密度与内参探针成像的的荧光光密度对比，计算lncRNA在食管鳞癌组织中的相对表达量。

进一步地，所述的lncRNA探针进行检测的方法包括：在组织中加入预杂交液，37℃封闭45-60min；避光条件下，分别lncRNA探针和内参探针加入到预热37℃的杂交液中，得到lncRNA探针杂交液和内参探针杂交液；弃去组织中的预杂交液，加入lncRNA探针杂交液或内参探针杂交液，37℃避光杂交过夜，避光清洗组织。

进一步地，所述的DNA染色采用DAPI进行。

本发明根据ATCG碱基互补原理，探针与组织中lncRNA特异性结合，特异性检测lncRNA的表达水平。DAPI为一种荧光染料，且对活细胞无毒副作用；可以与细胞核中的双链DNA结合。应用探针为cy3标记，在荧光激发下显红色荧光；DAPI在荧光激发下显蓝色荧光；两种荧光颜色对比明显。根据检测目标lncRNA成像位置，判断lncRNA是定位于细胞核还是细胞质，还是核质均匀表达。根据目标lncRNA成像的荧光光密度与内参lncRNA对比，可以计算lncRNA在肿瘤组织中的相对表达量。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的食管鳞癌组织内lncRNA的荧光原位杂交技术，成本低，操作简单，省时省力。本发明可以方便地检测食管鳞癌组织内lncRNA的表达水平，直观展示lncRNA在食管鳞癌组织中的亚细胞内定位情况。

2、lncRNA的荧光原位杂交图像成像质量高，可以直观展示lncRNA的表达水平及亚细胞内定位情况。

3、本发明可以直观展示lncRNA在肿瘤实质细胞中的表达情况，相比于RT-PCR，避免了肿瘤间质细胞的干扰。

4、该技术可应用于其他肿瘤组织内的lncRNA检测。

5、该技术易学易会，在生物医学研究领域及临床上可大规模推广应用。

附图说明

图1为应用lncRNA荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测目标lncRNA及18S内参对照在食管癌组织的表达情况图(×1600)。

图2为不同lncRNA原位检测方法结果对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：食管鳞癌组织中lncRNA的荧光原位杂交检测方法

一、试剂准备：

1)lncRNA FISH Probe Mix存储液(20μM)，恢复至室温(锐博生物公司，货号C10920)，该探针采用cy3标记。

2)U6，18s内参FISH Probe Mix储存液(20μM)，恢复至室温(锐博生物公司，货号分别为lnc110101，lnc110102)。

3)预杂交液：将适量Blocking Solution(锐博生物公司，货号：C10903)与1×Pre-hybridization Buffer(锐博生物公司，货号：C10901)按照1∶99混匀后，37℃孵育至透明澄清状态后，分装保存。使用前须在37℃气浴或水浴中孵育至澄清透明。

注：1×Pre-hybridization Buffer从低温取出时可能有沉淀析出，属于正常现象。

4)杂交液：将适量Blocking Solution(锐博生物公司，货号：C10903)与1×Hybridization Buffer(锐博生物公司，货号：C10902)按照1∶99混匀后，37℃孵育至透明澄清状态后，分装保存。使用前须在37℃气浴或水浴中孵育至澄清透明。

注：1×Hybridization Buffer从低温取出时可能有沉淀析出，属于正常现象。

5)4％多聚甲醛

6)通透液(含0.5％TritonX-100的1×PBS)

7)1×PBS

8)20×SSC(普洛麦格(北京)生物技术有限公司，货号：V4261)

9)DEPC水(碧云天生物技术研究所，货号：R0021)

10)杂交洗液I(4×SSC，0.1％Tween-20)(20×SSC经DEPC水稀释5倍)

11)杂交洗液II(2×SSC)(20×SSC经DEPC水稀释10倍)

12)杂交洗液III(1×SSC)(20×SSC经DEPC水稀释20倍)

13)1×DAPI染液(碧云天生物技术研究所，货号：C1005)

14)胶原蛋白酶IV(sigma公司，货号：C5138)

15)封片剂(指甲油)

16)防荧光猝灭剂(公司：碧云天生物技术研究所，货号：P0126)

二：实验方法：

本实施例以食管鳞癌组织进行FISH实验为例，具体步骤为：

1.制备冰冻食管鳞癌组织切片：

将新收取的新鲜组织在冰冻切片机上切片，厚度为6-8μm。切片放在常温下吹晾3min(防止后面的洗脱步骤中组织脱片)。

2.进行组织固定、消化与通透：

a.1×PBS清洗组织5min；

b.4％多聚甲醛室温固定10min；

c.1×PBS清洗组织5min，共3次；

d.胶原蛋白酶IV常温下消化组织0.5min；

e.1×PBS清洗组织5min，共3次；

f.每块组织上加入100μL预冷的通透液，4℃静置通透5min；

g.弃去通透液后，加入1×PBS清洗组织5min，共3次。

3.采用lncRNA探针进行检测：

a.每块组织加入100μL预杂交液，37℃封闭45-60min；

b.预杂交同时，将杂交液在37℃中预热。

c.避光条件下，分别把2.5μL 20μM lncRNA FISH Probe Mix储存液和2.5μL 20μM内参FISH Probe Mix储存液加入到100μL杂交液中，得到lncRNA探针杂交液和内参探针杂交液；

d.弃去每块组织中的预杂交液，加入100μL lncRNA探针杂交液或内参探针杂交液，避光，37℃杂交过夜；

注：探针杂交液的用量一般100μL即足以覆盖，具体依据组织大小待杂交区优化。

e.避光，50℃，杂交洗液I清洗组织3次，每次5min，以降低背景信号；

f.避光，50℃，杂交洗液II清洗组织1次，5min.

g.避光，50℃，杂交洗液III清洗组织1次，5min.

h.避光，1×PBS清洗组织1次，5min.

4.进行DNA染色

a.避光，室温下1×DAPI染色5min.

b.避光，1×PBS清洗组织3次，每次5min.

5.指甲油封片

避光条件下，在载玻片上滴加荧光防猝灭剂，用封片剂(如指甲油)将其固定于载玻片上，进行荧光检测。

注：小心封片，避免造成不必要的组织挫伤，封片的过程中尽量避免气泡的产生。

6.共聚焦显微镜检测成像：

LncRNA探针Cy3标记，发射波长570nm，激发波长550nm；DAPI激发波长364nm，发射波长454nm。

结果如图1所示，根据lncRNA成像位置，判断lncRNA是定位于细胞核还是细胞质，还是核质均匀表达，请根据图1具体解析。

本实施例中食管鳞癌组织中lncRNA成像的荧光光密度为0.805，18S内参探针成像的荧光光密度为3.673，lncRNA在食管鳞癌组织中的相对表达量为0.219。荧光光密度通过LEICA Qwin V3(德国Leica公司)图像分析系统测量，

注：也可用荧光显微镜检测成像，但成像效果不佳，推荐采用共聚焦显微镜进行检测成像。

图1为应用lncRNA荧光原位杂交技术检测目标lncRNA及18S内参对照在食管癌组织的表达情况图(×1600)。DAPI主要定位于细胞核，并呈蓝色，Cy3标记目标lncRNA呈红色，主要定位于细胞质。

图2为不同lncRNA原位检测方法结果对比图。荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测结果成像清晰，lncRNA背景残留较少，肿瘤间质不存在非特异性染色；DAB显色成像效果较差，且在肿瘤间质存在非特异染色；BCIP/NBT显色成像效果较差，且目标lncRNA显色弱，检测结果几乎呈阴性。