本发明属于生物技术领域，具体涉及一种天竺鲷科鱼类——印度洋银口天竺鲷的分子标记引物及鉴别方法。
背景技术：
印度洋银口天竺鲷(Jaydia striatodes)隶属于鲈形目、鲈亚目，分布于印度洋东部和西北太平洋，于我国分布于南部沿海。印度洋银口天竺鲷具有以下形态特征：背鳍鳍条数VII+I，9；臀鳍鳍条数II，8；胸鳍鳍条数15；侧线鳞数24+3；背前鳞数4，为栉鳞；第一鳃弓鳃耙数4–5+12–13(通常为5+13)；发达鳃耙数3+11–12(通常为3+12)；角鳃弓上的鳃耙数9；前鳃盖骨边缘转折处具弱锯齿，前鳃盖骨脊边缘光滑。该种与同属的横带银口天竺鲷(Jaydia striata)为姐妹群，两者形态特征非常相似，前者在我国曾被鉴定为后者，两者可通过发达上鳃耙数(3vs.2)、角鳃弓上的鳃耙数(9vs.8)和臀鳍颜色进行区分(臀鳍远端黑色vs.臀鳍浅色)。但是由于根据形态特征进行鉴定对专业技能和经验要求较高，且形态特征有时会发生变异，仅依靠形态特征进行鉴定仍然较为困难。因此有必要提出区别两种银口天竺鲷属鱼类的有效基因特征，从分子层面为该种的鉴定提供可靠依据。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于提供一种鉴别印度洋银口天竺鲷的方法，从基因特征上区别两种银口天竺鲷属鱼类，为该种的鉴定提供可靠依据，从而弥补现有技术的不足。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种鉴别印度洋银口天竺鲷的分子标记引物，所述的引物序列为FishF1:5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′,
FishR2:5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3′。
本发明还提供一种鉴别印度洋银口天竺鲷的方法，具体步骤如下：
提取印度洋银口天竺鲷和横带银口天竺鲷的DNA，对印度洋银口天竺鲷和横带银口天竺鲷的DNA中细胞色素c氧化酶I基因进行PCR扩增，扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞；对扩增结果纯化，测序，比对测序结果；印度洋银口天竺鲷COI基因片段序列为：TATCTAGTTTTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTCGGCACAGCTCTTAGCTTGCTCATCCGGGCTGAACTAAGCCAACCAGGGGCCCTCCTTGGCGATGACCAAATCTACAATGTAATCGTTACGGCACATGCATTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATCGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCTCTGATGATTGGTGCTCCTGATATAGCATTCCCCCGAATGAACAACATAAGTTTCTGATTACTCCCTCCCTCGTTCCTTCTTCTACTTGCCTCCTCAGGCGTAGAAGCGGGAGCCGGGACAGGATGGACAGTGTACCCCCCTCTTGCAGGCAATCTTGCCCACGCAGGCGCCTCTGTTGACCTAACAATCTTCTCCCTGCATCTTGCAGGGATCTCCTCAATTCTAGGGGCTATCAACTTTATTACAACAATTATCAACATGAAACCACCTGCCATTACTCAGTACCAGACGCCGTTGTTTGTCTGAGCCGTCCTTATTACGGCTGTTCTTCTTCTTCTATCCCTCCCTGTACTAGCCGCCGGCATTACAATGCTCCTAACTGACCGAAACCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCGGGAGGAGGGGA，种内遗传差异不大于1％；
所述步骤2的PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，rTaq 0.15ul，模板1ul，Primer各1ul。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明对印度洋银口天竺鲷和横带银口天竺鲷线粒体DNA COI基因各一条626bp的序列进行比对，结果显示存在66个变异位点，其中53个转换，13个颠换。比对两种鱼类不同个体的相同序列，所得结果基本一致。计算种内和种间遗传距离，显示印度洋银口天竺鲷样品与横带银口天竺鲷样品具有约12％的种间差异，而我国北部湾、越南、泰国湾和菲律宾的的印度洋银口天竺鲷样品和泰国湾和马来西亚的横带银口天竺鲷样品分别具有0-1.0％和0-0.2％的种内差异。COI基因片段能有稳定有效地区分印度洋银口天竺鲷和横带银口天竺鲷。
本发明从分子水平探索了印度洋银口天竺鲷与其姐妹种横带银口天竺鲷线粒体COI基因片段序列的差异，提出了印度洋银口天竺鲷和横带银口天竺鲷的分子鉴别方法。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进行详细的描述。
实施例1：对采集自我国广西北海市沿海的印度洋银口天竺鲷与采集自马来西亚的横带银口天竺鲷进行区分。
合成引物FishF15’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′,
FishR2:5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3′；提取所述印度洋银口天竺鲷和横带银口天竺鲷DNA,对其线粒体DNA中的细胞色素c氧化酶I基因(COI)进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，rTaq 0.15ul，模板1ul，Primer各1ul；
扩增程序为94℃预变性5min，(94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec)×35个循环，72℃延伸10min，4℃保存∞；扩增结果经纯化、测序，对比序列结果，结果显示存在66个变异位点，其中53个转换，12个颠换。计算种内和种间遗传距离，显示印度洋银口天竺鲷和横带银口天竺鲷样品之间存在约12％的遗传差异，而两者种内遗传差异不足1％，有效的区分了两种鱼类。
所述印度洋银口天竺鲷COI基因片段序列为：
TATCTAGTTTTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTCGGCACAGCTCTTAGCTTGCTCATCCGGGCTGAACTAAGCCAACCAGGGGCCCTCCTTGGCGATGACCAAATCTACAATGTAATCGTTACGGCACATGCATTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATCGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCTCTGATGATTGGTGCTCCTGATATAGCATTCCCCCGAATGAACAACATAAGTTTCTGATTACTCCCTCCCTCGTTCCTTCTTCTACTTGCCTCCTCAGGCGTAGAAGCGGGAGCCGGGACAGGATGGACAGTGTACCCCCCTCTTGCAGGCAATCTTGCCCACGCAGGCGCCTCTGTTGACCTAACAATCTTCTCCCTGCATCTTGCAGGGATCTCCTCAATTCTAGGGGCTATCAACTTTATTACAACAATTATCAACATGAAACCACCTGCCATTACTCAGTACCAGACGCCGTTGTTTGTCTGAGCCGTCCTTATTACGGCTGTTCTTCTTCTTCTATCCCTCCCTGTACTAGCCGCCGGCATTACAATGCTCCTAACTGACCGAAACCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCGGGAGGAGGGGA；
所述横带银口天竺鲷COI基因片段序列为：
TATCTAGTTTTTGGTGCCTGAGCTGGAATAGTCGGTACGGCCCTTAGCTTGCTTATCCGAGCTGAGCTAAGTCAACCCGGGGCTCTCCTTGGCGATGACCAGATCTACAATGTAATCGTTACAGCACATGCATTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATTGGAGGCTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTAATGATTGGTGCCCCTGATATAGCATTCCCTCGAATAAACAACATGAGTTTCTGGTTGCTCCCTCCCTCATTTCTTCTTCTACTTGCCTCCTCAGGTGTTGAAGCCGGGGCCGGAACAGGATGAACAGTTTATCCCCCTCTTGCAGGCAATCTTGCCCACGCAGGAGCATCTGTTGATTTAACAATTTTTTCTTTACATCTTGCAGGTATTTCCTCAATTCTAGGAGCTATTAACTTTATTACAACAATTATTAATATGAAACCACCTGCCATCACTCAGTATCAAACACCCCTGTTTGTCTGAGCCGTCCTTATTACAGCTGTACTTCTTCTTTTATCCCTCCCTGTTCTAGCTGCCGGCATTACAATGCTCCTCACCGATCGAAACCTCAATACAACCTTCTTTGACCCAGCAGGAGGGGGAGA。
两个物种COI基因片段序列比对结果如下：
TATCTAGTTTTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTCGGCACAGCTCTTAGC..............................................T.......................T....G....C............TTGCTCATCCGGGCTGAACTAAGCCAACCAGGGGCCCTCCTTGGCGATGA..........T..........A...........G...........T...........C...........T............................CCAAATCTACAATGTAATCGTTACGGCACATGCATTTGTAATAATTTTCTTTA......G.......................................A......................................................TAGTAATACCAATTATGATCGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCTCTGAT....................................T........................A.....T...........................A....GATTGGTGCTCCTGATATAGCATTCCCCCGAATGAACAACATAAGTTTCTGA..................C..................................T..........A................G................G TTACTCCCTCCCTCGTTCCTTCTTCTACTTGCCTCCTCAGGCGTAGAAGCGG....G.....................A....T..............................................T....T............C..GAGCCGGGACAGGATGGACAGTGTACCCCCCTCTTGCAGGCAATCTTGCC..G............A.................A...........T....T................................................CACGCAGGCGCCTCTGTTGACCTAACAATCTTCTCCCTGCATCTTGCAGGG.................A.....A................TT...............T....T....TT...A.......................T ATCTCCTCAATTCTAGGGGCTATCAACTTTATTACAACAATTATCAACATGA....T...........................A...........T.......................................T.....T.........AACCACCTGCCATTACTCAGTACCAGACGCCGTTGTTTGTCTGAGCCGTCC...........................C................T.....A....A.....CC....................................TTATTACGGCTGTTCTTCTTCTTCTATCCCTCCCTGTACTAGCCGCCGGCATT.............A..........A..................T.........................T...........T...............ACAATGCTCCTAACTGACCGAAACCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCG......................C....C.....T.................C...............................................AGGAGGAGGGGA。
...........G......A....。
实施例2：对采集自我国海南岛西北海域的印度洋银口天竺鲷与采集自泰国湾的横带银口天竺鲷进行区分。
合成引物FishF1和FishR2，提取所述印度洋银口天竺鲷和横带银口天竺鲷DNA,对其线粒体DNA中的细胞色素c氧化酶I基因(COI)进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，rTaq 0.15ul，模板1ul，Primer各1ul。
扩增程序为94℃预变性5min，(94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec)×35个循环，72℃延伸10min，4℃保存∞；扩增结果经纯化、测序，对比序列结果,结果显示存在68个变异位点，其中57个转换，11个颠换。计算遗传距离，发现印度洋银口天竺鲷和横带银口天竺鲷样品之间存在约12％的遗传差异，而两者种内遗传差异均不足1％，有效的区分了两种鱼类。
具体比较结果如下：
TATCTAGTTTTTGGTGCCTGAGCCGGGATAGTCGGCACAGCTCT......T........................................T.....A.................T....G....C....TAGCTTGCTCATCCGGGCTGAACTAAGCCAACCAGGGGCCCTC..................T............A.........G...........T...........C............T.......CTTGGCGATGACCAAATCTACAATGTAATCGTTACGGCACATGC.............................G.......................................A................ATTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATCGGAGGC..........................................................................T.............TTTGGGAACTGACTAATTCCTCTGATGATTGGTGCTCCTGATATA..........A.....T...........................A......................C..................GCATTCCCCCGAATGAACAACATAAGTTTCTGATTACTCCCTCC................T..........A..................G...............G.....G................CTCGTTCCTTCTTCTACTTGCCTCCTCAGGCGTAGAAGCGGGAG.......A...T.............................................T....T............C.....G..CCGGGACAGGATGGACAGTGTACCCCCCTCTTGCAGGCAATCT.........A.................A...........T....T........................................TGCCCACGCAGGGGCCTCTGTTGACCTAACAATCTTCTCCCTGC.........................A......A...............TT..............T....T.....TT...A...ATCTTGCAGGGATCTCCTCAATTCTAGGGGCTATCAACTTTATTA....................T.....T............................A..........T....................CAACAATTATCAACATGAAACCACCTGCCATTACTCAGTACCAG....................T.....T...................................C................T....AACGCCGTTGTTTGTCTGAGCCGTCCTTATCACGGCTGTTCTTCTT.....A....CC...........................................T.....A...........A...........CTTCTATCCCTCCCTGTACTAGCCGCCGGCATTACAATGCTCCTA......T.........................T..........T.......................................CACTGACCGAAACCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCGGGAG.....C.....T................C...............................................A.........GAGGGGA。
...G....A......。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种鉴别邵氏鱚与多鳞鱚的分子标记引物及方法
<130> 无
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物序列为 FishF1
<400> 1
tcaaccaacc acaaagacat tggcac 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物FishR2
<400> 2
acttcagggt gaccgaagaa tcagaa 26
<210> 3
<211> 626
<212> DNA
<213> Apogonidae
<400> 3
tatctagttt ttggtgcctg agccggaata gtcggcacag ctcttagctt gctcatccgg 60
gctgaactaa gccaaccagg ggccctcctt ggcgatgacc aaatctacaa tgtaatcgtt 120
acggcacatg catttgtaat aattttcttt atagtaatac caattatgat cggaggcttt 180
gggaactgac taattcctct gatgattggt gctcctgata tagcattccc ccgaatgaac 240
aacataagtt tctgattact ccctccctcg ttccttcttc tacttgcctc ctcaggcgta 300
gaagcgggag ccgggacagg atggacagtg tacccccctc ttgcaggcaa tcttgcccac 360
gcaggcgcct ctgttgacct aacaatcttc tccctgcatc ttgcagggat ctcctcaatt 420
ctaggggcta tcaactttat tacaacaatt atcaacatga aaccacctgc cattactcag 480
taccagacgc cgttgtttgt ctgagccgtc cttattacgg ctgttcttct tcttctatcc 540
ctccctgtac tagccgccgg cattacaatg ctcctaactg accgaaacct aaatacaacc 600
ttctttgacc cagcgggagg agggga 626
<210> 4
<211> 626
<212> DNA
<213> Apogonidae
<400> 4
tatctagttt ttggtgcctg agctggaata gtcggtacgg cccttagctt gcttatccga 60
gctgagctaa gtcaacccgg ggctctcctt ggcgatgacc agatctacaa tgtaatcgtt 120
acagcacatg catttgtaat aattttcttt atagtaatac caattatgat tggaggcttt 180
ggaaattgac taattcctct aatgattggt gcccctgata tagcattccc tcgaataaac 240
aacatgagtt tctggttgct ccctccctca tttcttcttc tacttgcctc ctcaggtgtt 300
gaagccgggg ccggaacagg atgaacagtt tatccccctc ttgcaggcaa tcttgcccac 360
gcaggagcat ctgttgattt aacaattttt tctttacatc ttgcaggtat ttcctcaatt 420
ctaggagcta ttaactttat tacaacaatt attaatatga aaccacctgc catcactcag 480
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ctccctgttc tagctgccgg cattacaatg ctcctcaccg atcgaaacct caatacaacc 600
ttctttgacc cagcaggagg gggaga 626