本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及筛选低氧适应性绵羊的方法。
背景技术：
：我国海拔3000m以上的高原占全国总面积的1/6。在海拔高度5000m以下低空，海拔高度每上升100m，气压降低约1KPa。海拔高度3000m的高原大气氧含量仅为海平面地区的73％，海拔高度5000m地区的大气氧含量仅为海平面地区的53％。因此，高原地区的低气压与低氧分压是主要生态因子，严重地影响着动物与人的生存和发展。在我国面积最大的牧区——青藏高原牧区约有20亿亩可利用的高寒草场，其中绵羊业是当地畜牧业的主要部门。然而，目前青藏高原的大部分绵羊为藏系绵羊。藏羊体质强健，耐粗饲，善游牧，但生长速度慢、产肉性能极低、繁殖力弱。一些国内外著名肉羊品种，如小尾寒羊、杜泊羊、特克赛尔羊、肉用美利奴羊已在国内许多地区成功引种、推广。然而，高原特有的高寒低氧环境造成引进的品种或者引进品种与当地品种的杂交后代很难适应高寒缺氧环境。血液生理是低氧适应性的一个重要方面，作为血液中气体的主要载体，红细胞特性与低氧适应性直接相关。海拔可以影响红细胞特性，血红蛋白是血液内运送氧和二氧化碳的载体，将氧由肺运送到组织，又将二氧化碳从组织运到肺部。所以血红蛋白量增加有利于气体运输。红细胞的产生是一个可遗传的性状，可用分子标记预测红细胞特性，进而可以对低氧适应性绵羊进行筛选。绵羊低氧适应性分子遗传标记位于18号染色体上19272.8-19322.8kb，将包括绵羊参考基因组在内的含有该区域的基因型记为参考型。除参考型外，在部分品系或个体的基因组中，该区域在测序中表现出缺失，由此产生的多态性记为缺失型。与缺失型相比，基因组参考型个体表现出较高的血红蛋白浓度和较小的平均细胞体积，从而有利于在低氧环境中生存。然而目前分子生物学上对大片段插入/缺失的检测缺乏有效手段。理论上可用的检测方法有：全基因组测序、Southern印记杂交、免疫荧光原位杂交(FISH)还有近年来发展的长片段PCR技术和多重连接探针扩增技术(MLAP)。这些检测方法对样品、技术设备、实验成本高。另外直接通过该基因簇中基因序列的差异检测也比较困难，原因是该区域是由多个高同源性的基因家族组成的基因簇，很难设计出特异引物。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提出一种筛选低氧适应性绵羊的方法，该方法所需样本量小，技术操作简单，成本低，大大提高育种和引种的效率。本发明基于绵羊18号染色体19272.8-19322.8kb的大片段丢失变异与绵羊平均血红蛋白浓度以及平均红细胞体积显著相关，进而与绵羊低氧适应性密切相关。通过分析得到与18号染色体19272.8-19322.8kb的大片段丢失变异高度连锁(r2>0.6)的314个单核苷酸多态性(SNP)位点，通过检测SNP位点预测个体的低氧适应性特性，筛选出低氧适应性较强的绵羊的品系和杂交个体。基于上述目的本发明提供的筛选低氧适应性绵羊的方法，包括以下步骤：1)提取待检测绵羊的基因组DNA；2)检测与绵羊18号染色体上19272.8-19322.8kb区域基因的缺失紧密连锁的SNP位点中的一个或多个位点；3)通过SNP位点的分型，将绵羊分为高原型、平原型与杂合型，其中，高原型绵羊具有低氧适应性。其中，所述与绵羊18号染色体上19272.8-19322.8kb区域基因的缺失紧密连锁的SNP位点的连锁系数r2>0.6。可选地，步骤2)中检测SNP位点的方法是等位基因特异性PCR法。可选地，步骤2)中检测SNP位点的方法是TaqMan探针法。可选地，所述等位基因特异性PCR法是根据选取的紧密连锁SNP位点中的一个或多个位点，设计用于扩增该一个或多个SNP位点的引物，通过基因克隆、基因测序判断SNP位点的分型，筛选低氧适应性的绵羊。可选地，所述TaqMan探针法是根据选取的紧密连锁SNP位点中的一个或多个位点，设计相应的探针，通过该探针检测SNP位点的分型，筛选低氧适应性的绵羊。可选地，所述探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。可选地，所述探针的5’端标记有报告荧光基团是VIC或FAM，3’端标记有淬灭荧光基团是TAMRA或MGB。基于相同的发明构思，本发明还提供了上述筛选低氧适应性绵羊的方法在低氧适应性绵羊辅助引种中的应用；在低氧适应性绵羊杂交选育中的应用。从上面所述可以看出，本发明提供的筛选低氧适应性绵羊的方法，通过分析与18号染色体19272.8-19322.8kb的大片段丢失变异高度连锁(r2>0.6)的SNP位点，判断该区域是否存在大片段丢失变异，进而预测绵羊的低氧适应性特性。该方法所需样本量小，技术操作简单，成本低，大大提高育种和引种的效率。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。根据国际绵羊基因组组织(ISGC)的70只羊的重测序的数据，分析测序结果，发现了与绵羊OAR3.1版本参考基因组18号染色体19272.8-19322.8kb的大片段丢失变异紧密连锁的314个SNP位点(见表1)，其中，r2值表示这个SNP和大片段缺失的连锁程度。该314个SNP位点的分型与该区域是否缺失紧密相关，可以用于筛选低氧适应性绵羊，其中高原型表示具有低氧适应性。表1：与18号染色体19272.8-19322.8kb的大片段丢失变异紧密连锁的314个SNP位点信息本发明提供的筛选低氧适应性绵羊的方法，包括以下步骤：1)提取待检测绵羊的基因组DNA；2)检测与绵羊18号染色体上19272.8-19322.8kb区域基因的缺失紧密连锁的314个SNP位点中的一个或多个位点；3)通过SNP位点分型，将绵羊分为高原型、平原型与杂合型，其中，高原型绵羊具有低氧适应性。选取其中编号155的SNP19342316位点，进行方法有效性验证。实施例1：TaqMan探针法检测SNP19342316位点的分型及其预测效率验证1、试验动物：试验动物来自美国爱达荷州杜布瓦实验站。共三个品种哥伦比亚(N＝145)的Polypay(N＝438)、和兰布莱(N＝414)品种，均为1-5岁的纯种母羊。采用相似的饲养管理。2、红细胞特性分析：由颈静脉穿刺，使用EDTA包被的真空采血管收集全血。所有参数由PhoenixLabs,Inc.按照试验标准测量，所有引用的参考值也由该实验室提供。直接测量的指标：红细胞计数(RBC，M/ml，参考范围：4.0-12.0M/ml)；血红蛋白含量(HGB，g/dl，参考范围：9.0-15.0g/dl)；红细胞压积(HCT，％，参考范围：27.0-45.0％)。三个派生指标：平均红细胞体积(MCV，以fL、参考范围：28.0-40.0fL),计算公式：MCV(μm3)＝红细胞压积(％)x10/红细胞计数(百万/mm3)；平均红细胞血红蛋白(MCH，单位pg，参考范围:8.0-12.0pg)，计算公式MCH(pg)＝血红蛋白浓度(g/100ml)x10/红细胞计数(百万/mm3)；平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC，单位为％，参考范围：31.0-35.0％)，计算公式：MCHC(g/100m)＝血红蛋白浓度(g/100ml)x100/红细胞压积(％)。3、含有SNP19342316位点的片段的获得以及分型检测：常规方法提取样品基因组DNA，使用TaqManH(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)基因分型方法检测SNP19342316位点多态性及分型。根据SNP19342316位点设计如下引物及探针，具体实验步骤参考TaqManH(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)产品说明书。扩增引物1：5’-CCGGTTCATCCTTGAGAAACTCTT-3’；扩增引物2：5’-CCCCACAGATGTGCTAATGGT-3’；探针1(检测A)：5’-CCTCCTCTTCTTCAACC-3’；探针2(检测G)：5’-CTCCTCCTCTTCAACC-3’。所述探针1和探针2的5’端分别标记有报告荧光基团VIC和FAM，3’端分别标记有淬灭荧光基团TAMRA和MGB。根据荧光信号的释放判断样品中的SNP类型高原型(AA)，平原型(GG)或者杂合型(AG)。4、SNP19342316位点的分型的预测效力验证步骤3检测的SNP19342316位点的分型与红细胞特性值的关联分析如表2所示：高原型等位基因(A)与正常范围以外的血红蛋白增加和细胞体积降低显著相关，而平原型等位基因(G)表现出正常的范围。结果表明SNP19342316位点的分型为高原型(AA)的个体型具有较高的血红蛋白浓度和较小的红细胞体积，因而更适应低氧环境。表明SNP19342316位点作为分子标记可对绵羊红细胞特性进行有效预测，筛选低氧适应性绵羊。表2：红细胞重要特性值与SNP19342316位点分型的关系AAAGGG标准化P值红细胞平均血红蛋白浓度(％)36.25234.40233.9916.2*10-14平均红细胞体积(fl)32.39833.92334.5632.5*10-6实施例2：等位基因特异性PCR检测SNP19342316位点的分型及预测效力验证试验动物、红细胞特性分析同实施例1。根据SNP19342316位点设计如下等位基因特异性PCR引物组，对所有样品进行扩增：缺失型(高原型)：5’-TGCAAGACTGGTTCACCCCAGAT-3’5’-CCGGCTTTATGTCAGTGATACGTG-3’产物为330bp。参考型(平原型)：5’-TAGAAGTACTCCTACCTGAACGA-3’5’-CCAAACAAATCCCTGAGCCATTTC-3’产物为719bp。使用TaqManH通用PCR混合物，按照说明书进行PCR。初始变性95℃10分钟，之后每个循环95℃30秒，64℃30秒，68℃1分钟，40个循环。PCR产物进行凝胶电泳及显像。参考型仅能在引物为参考型引物时得到条带，缺失型仅能在引物为缺失型引物时得到条带，杂合型两种引物均有条带。SNP19342316位点的分型与红细胞特性值的关联分析如表3所示：缺失型(高原型)与正常范围以外的血红蛋白增加和细胞体积降低显著相关，而参考型(平原型)表现出正常的范围。结果表明缺失型个体具有较高的血红蛋白浓度和较小的红细胞体积，因而更适应低氧环境。19272.8-19322.8kb的大片段缺失标记可对绵羊红细胞特性进行有效预测，进而筛选低适氧性绵羊。表3：红细胞重要特性值与等位基因特异性PCR检测SNP19342316位点分型的关系缺失型杂合型参考型标准化P值红细胞平均血红蛋白浓度(％)36.134.333.91.1*10-13平均红细胞体积(fl)32.333.634.36.2*10-6实施例3：SNP19342316位点的分型在不同种群中的分布从Hapmap数据库中选取了几个国内已经引进主要品系，以及藏羊和生活在克什米尔高原上的张坦羊。比较研究SNP19342316位点的分型及频率。如表4所示，藏羊全部都表现出纯合AA分型(高原型)，来自克什米尔张坦地区海拔4000米左右的张坦羊和来自北欧芬兰高地的芬兰羊也呈现出很高的A(高原型)频率(0.996，0.854)。相对的，来自欧洲平原地区的个体大部分表现出较高比例的GG分型(平原型)。结果表明高原环境中生存的绵羊几乎全部为高原型。表4：SNP19342316位点分型频率在几个主要品种中的分布品系/产地样本数AAAGGGA基因频率原产地澳洲美利奴羊5002480.02西南欧中国美利奴羊2319130.239西南欧澳洲无角陶赛特羊108739620.245东欧新西兰罗姆尼羊24110130.25东欧伊朗萨福克羊55425260.3东欧苏格兰特克塞尔羊801840220.475东欧新西兰特克塞尔羊2461350.521东欧非洲杜泊羊2110920.69非洲芬兰羊99742140.854北欧张坦羊2927200.966亚洲藏羊3737001亚洲实施例4：等位基因特异性PCR法和TaqMan探针法检测世界不同海拔、不同品种羊中的SNP19342316位点分型从NCBI下载了世界绵羊基因组组织测序的40个品种的70个绵羊个体的～10X基因组重测序序列。然后利用BWA软件将所有序列对应到绵羊参考基因组OARv3.1上，通过统计该标记区域(18号染色体19272.8-19322.8kb)测序深度评估此区域的序列覆盖度是否约为平均覆盖度的100％，50％和0％，由此判断这个区域是否是片段存在纯合型、片段存在和丢失并存的杂合型，以及片段丢失纯合型。结果如表5所示：除一只东部藏羊外，其他个体的SNP19342316位点分型均与缺失型相符(GG对应参考型，AA对应缺失型，AG对应杂合型)，说明SNP19342316位点的分型与基因缺失有很好的相关性。另外，该组数据独立验证了实施例1中的SNP19342316以及基因缺失多态性在不同物种中的分布频率。即，高原品系A和参考型频率较高。表5：全世界不同品系部分个体的缺失以及SNP19342316分型比较个体编号测序覆盖率是否缺失SNP分型原产地1美利奴10参考型GG西南欧2美利奴20.000576参考型GG西南欧3美利奴30.001079参考型GG西南欧4无角陶赛特羊0.00223参考型GG东欧5杜泊羊10.557122杂合型AG非洲6杜泊羊21.228633缺失型AA非洲7特克塞尔羊1.328273缺失型AA东欧8张坦羊11.141295缺失型AA亚洲帕米尔高原9张坦羊21.194676缺失型AA亚洲帕米尔高原10北部藏羊1.460935缺失型AA亚洲青藏高原11东部藏羊0.481583杂合型AA亚洲青藏高原实施例5：藏羊中的SNP19342316位点分型从西藏阿里高海拔地区环境(>4000m)中长期适应生活的藏绵羊随机挑选了20只，进行10X的基因组重测序，进行同上数据处理和分析，结果20只藏羊的SNP19342316位点全部为AA，即高原型，具有低氧适应性。该实验进一步验证了本发明所提供的筛选低氧适应性绵羊的方法的有效性。实施例6：选取其余313个SNP位点重复实施例1-5的实验，均可准确筛选低氧适应性绵羊，准确率达90％以上。实施例7：选取r2<0.6的SNP位点重复实施例1-5的实验，发现筛选低氧适应性绵羊的准确率出现明显下降。例如，对于r2＝0.552的SNP位点，准确率为74％；对于r2＝0.496的SNP位点，筛选准确率为51％；对于r2＝0.33的SNP位点，筛选准确率下降到43％。因此，利用紧密连锁SNP位点筛选低氧适应性绵羊的准确率与连锁系数r2存在关联性，根据实验结果，只有r2>0.6的SNP位点才能保证与18号染色体19272.8-19322.8kb的大片段丢失变异的高度连锁性，从而保证筛选准确率。当r2<0.6时，连锁不平衡关联性逐渐弱化，尽管r2>0.33一般公认为仍属紧密关联，但是0.33<r2<0.6的SNP位点已经很难确保与18号染色体19272.8-19322.8kb的大片段丢失变异的一致性，难以满足筛选准确性的要求。大片段缺失是造成红细胞表型变异的基本原因，但是大片段缺失较难检测。另外，现在分子生物学很难找到决定性状的突变位点，因而，目前找到的大部分分子标记都是和未知决定性突变连锁的SNP位点。本发明提供的筛选低氧适应性绵羊的方法，通过分析与18号染色体19272.8-19322.8kb的大片段丢失变异高度连锁(r2>0.6)的314个SNP位点，判断该区域是否存在大片段丢失变异，进而预测绵羊的低氧适应性特性。该方法所需样本量小，技术操作简单，成本低，大大提高育种和引种的效率，方法灵活，可根据不同样本选择不同的SNP位点。并可采用TaqMan探针法或等位基因特异性PCR法进行检测，准确性高，重复性好。所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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