刺槐素的制备方法与流程

本发明涉及一种从香青兰中提取分离得到刺槐素的方法。

背景技术：

经文献检索，刺槐素的提取方法已有一些文献报道：

陈政雄(中药黄酮类的研究VIII.野菊花成分的研究(第一报)[J].药学学报，1962(06).)首次报道从野菊花分离得到刺槐素的结构，该工艺采用提取、萃取、重结晶、水解等技术联合从野菊花菊中分离得到刺槐素，操作复杂、步骤繁琐且产量低。

刺槐素的结构式为：

陈维佳(野菊花化学成分及总黄酮提取工艺研究[D].山东中医药大学，2009.)采用乙醇回流提取、萃取、硅胶柱、SephadexLH-20柱反复柱层析从6kg的野菊花中分离得到11.8mg刺槐素，工艺操作复杂且产量低。

丁智慧(飞机草中的化学成分[J].天然产物研究与开发，2001，13(5)：22-24.)采用甲醇回流提取、萃取、硅胶柱反复柱层析从2.48kg的飞机草中分离得到0.318g刺槐素，该工艺操作步骤繁琐。

同时，有3篇与刺槐素提取方法有关的中国专利：

王秀敏等的发明专利(从野菊花中分离制备刺槐素单体的方法：CN，CN 103193748 A[P].)采用提取、大孔树脂柱色谱、水解、高速逆流色谱法等技术从1kg野菊花植物分离得到10mg刺槐素，该工艺采用了5种技术联合进行分离，操作复杂、成本较高、收率低。

卞毓平等的发明专利(一种从菊花中提取刺槐素的方法：CN，CN 102491964 A[P].)采用萃取、大孔树脂、聚酰胺柱层析和重结晶等技术从10kg菊花植物中分离得到1.2g的刺槐素，操作复杂、步骤繁琐。

刘晓秋等的发明专利(一种柳穿鱼黄酮及其总黄酮的制备方法和用途CN，CN 101475619 A[P].)采用回流提取、大孔树脂、聚酰胺柱层析、硅胶柱层析和SephadexLH-20柱层析等技术分离得到刺槐素，该工艺采用5种技术联合进行分离，操作复杂、步骤繁琐。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从香青兰中提取分离得到刺槐素的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

a、将香青兰干燥的地上部分粉碎，用5～10倍量的40％～95％乙醇浸泡12～24h；

b、采用渗漉法，香青兰药材与40％～95％乙醇比例1∶30～40，流速1～6mL/min，收集渗漉液；

c、渗漉液用孔径0.1～10mm的网孔过滤1～5次，滤液合并；

d、用减压蒸馏装置，在压力：0.08～0.1Mpa，温度：30～60℃下，蒸馏除去乙醇得0.8～1.2g/mL的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉；

e、将浸膏粉采用70％～100％乙醇溶解后干法拌样，上100～200目聚酰胺进行柱层析，采用20～95％乙醇梯度洗脱，并收集60～75％乙醇梯度的洗脱液，每个梯度洗脱液为4～5倍量柱体积；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.08～0.1Mpa，温度：40～60℃下蒸干得浸膏粉；

f、为了进一步纯化所得浸膏粉，滤去杂质，采用95％乙醇对浸膏粉进行重结晶，所得制备液用减压蒸馏装置，在压力：0.08～0.1Mpa，温度：40～60℃下蒸干得单体刺槐素。

有益技术效果

本专利采用聚酰胺柱层析和重结晶技术联合的方法，方法简单，步骤简短。从1kg香青兰植物中分离得到0.71g的刺槐素，转移率较高。

本发明获得的刺槐素纯度高，达到99％。

附图说明

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的上述和其他目的、特征和优点作出进一步详细的说明。

图1为本发明提供方法的工艺流程图；

图2为根据本发明一个实施例所制备的刺槐素的紫外光谱(UV)图；

图3为根据本发明一个实施例所制备的刺槐素的红外光谱(IR)图；

图4为根据本发明一个实施例所制备的刺槐素的电喷雾质谱(ESI-MS)图；

图5为根据本发明一个实施例所制备的刺槐素的核磁共振氢谱(¹H-NMR)图；

图6为根据本发明一个实施例所制备的刺槐素的核磁共振碳谱(¹³C-NMR)图。

具体实施方式

本发明提供的一种刺槐素的制备方法，包括获得香青兰的提取物，以及对提取物进一步纯化、层析、结晶等步骤。下面结合附图，详述本发明所提供的方法。

如图1所示，首先，将1份重量的香青兰干燥的地上部分粉碎，用15～25重量倍数的40～95vol％的醇溶液提取，例如可以选用乙醇或甲醇或丙醇或它们的任意混合物渗漉提取1～2次，每次提取6～24h。然后，将提取液浓缩，例如可以采用减压浓缩的方法，浓缩后提取液呈膏状。之后再将膏状物干燥，例如可以采用真空干燥的方法，将膏状物制成浸膏粉。

将浸膏粉用醇溶液纯化，得到溶液。纯化用的醇溶液包括，但不限于甲醇、乙醇、丙醇，以及它们的任意组合。优选乙醇，纯化的次数一般为1～2次。

将纯化后的溶液置于60℃水浴锅中拌入聚酰胺粉，不断搅拌直至溶剂挥干，聚酰胺拌入量为浸膏量的1/5。

将拌好样品，进行聚酰胺柱层析。层析的步骤可以为：加适量水于拌样聚酰胺中，使其呈混悬状上样。上柱完毕后，按梯度比例通入流动相进行洗脱。流动相采用复合洗脱剂，该复合洗脱剂由A组分和B组分构成，复合洗脱剂中A组分为乙醇且B组分为蒸馏水时，A组分与B组分的体积比为0∶100、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1、11∶1。例如流动相可以采用乙醇-水或乙酸乙酯-乙醇，优选乙醇-水。此时刺槐素的组分主要在流动相乙醇-蒸馏水体积比为3∶2、3∶1时被洗脱。最后，合并相同组分洗脱液并浓缩，得到得到浸膏粉。

进一步地，为了提高刺槐素的收率，还可利用醇溶液，特别是95vol％的乙醇-水溶液，再对上述浸膏粉进行重结晶，即得到淡黄色粉末状结晶，为刺槐素成品，其纯度可达98％以上。经UV、IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR对所得组分的结构进行鉴定，可知其为刺槐素。

图2、图3为根据本发明的制备方法制备的刺槐素的UV图谱和IR图谱。

图4为根据本发明的制备方法制备的刺槐素的ESI-MS图谱，根据刺槐素的ESI-MS的分析可知，ESI-MS特征峰在m/z 285.20[M⁺](正离子)，m/z 250.2[M+2OH^-]，m/z 302.4[M⁺+CH₃]，m/z330.4[M⁺+2OCH₃^-]。再结合图5、图6所示的根据本发明的制备方法制备的刺槐素的NMR图谱分析，可确定其分子量为284.2，分子式为C₁₆H₁₂O₅，其中，¹H-NMR(400MHz，DMSO)图谱中表现出典型的黄酮苷类化合物的氢谱特征，通过耦合常数及化学位移可确定每个氢的归属，δ：12.92(1H，S，5-OH)，8.04(2H，d，J＝8.8Hz，H-2′，6′)，7.11(2H，d，J＝8.8Hz，H-3′，5′)，6.87(1H，d，H-3)，6.50(1H，d，J＝1.7Hz，H-8)，6.20(1H，d，J＝1.7Hz，H-6)，3.86(3H，s，OCH3)；¹³C-NMR(DMSO，400MHz)图谱中呈现出16个碳信号，为1个CH3，8个CH，7个季碳，δc表明分子中含一个羰基(δ181.78)，δ：163.29(C-2)，103.54(C-3)，181.78(C-4)，164.39(C-7)，162.32(C-4′)，161.46(C-9)，128.34(C-2′，6′)，122.84(C-1′)，114.60(C-3′，5′)，103.71(C-10)，98.95(C-8)，94.07(C-6)，55.57(OCH3)。因此，可确定所得化合物为刺槐素。

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：从香青兰中提取分离得到刺槐素的方法，按以下步骤进行：

a、将香青兰干燥的地上部分粉碎，用10倍量的40％乙醇浸泡24h；

b、采用渗漉法，香青兰药材3.6kg与75％乙醇比例1∶40，流速6mL/min，收集乙醇渗漉液；

c、渗漉液用孔径0.5mm的网孔过滤2次，滤液合并；

d、用减压蒸馏装置，在压力：0.08Mpa，温度：30～60℃下，蒸馏除去乙醇得1.2g/mL的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉500g；

e、将100g浸膏粉采用70％乙醇溶解后干法拌样，上100～200目聚酰胺进行柱层析，采用40～95％乙醇梯度洗脱，得到洗脱液共90000mL，并收集60～75％乙醇梯度的洗脱液38000mL，每个梯度洗脱液为4倍量柱体积；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.1Mpa，温度：40℃下蒸干得浸膏粉10.0g；

f、为了进一步纯化所得浸膏粉，滤去杂质，采用100倍量的95％乙醇对所述浸膏粉进行重结晶，所得制备液用减压蒸馏装置，在压力：0.08Mpa，温度：40℃下蒸干得淡黄色结晶0.51g。

一、结构鉴定：取所得样品分别对UV、IR、MS、NMR进行归峰解谱，确定实施例1所提纯的样品为刺槐素。

二、纯度鉴定：

熔点(mp)测定：263℃～265℃。

薄层色谱检测：采用两种展开体系进行检测，薄层板用聚酰胺薄膜。展开剂A为乙醇-甲酸水(体积比为1∶1)，R_fA为0.33；展开剂B为乙酸乙酯-95％乙醇(体积比为6∶4)，R_fB为0.61，紫外365nm下见黄色斑点，无杂质点。

HPLC检测：用HPLC外标法测定含量，选定260nm和330nm为检测波长。选用乙腈-0.1％磷酸水溶液(80∶20，V/V)为流动相，以刺槐素为对照品。精密称取实施例1制备的淡黄色粉末2.50mg于100mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度线。经Waters分析型高效液相色谱检测，外标法定量，其纯度为99.12％。

得率计算：

刺槐素浓度为24.78μg·mL^-1，香青兰中刺槐素的量为2.88g/kg。

得率＝(24.78μg·mL^-1×100mL)/(2.50mg×3600g/2.56g×2.88g/kg)×100％＝24.47％

经检测，实施例1提取得到的刺槐素的纯度为99.16％，得率为24.47％。

实施例2：从香青兰中提取分离得到刺槐素的方法，按以下步骤进行：

a、将香青兰干燥的地上部分粉碎，用10倍量的75％乙醇浸泡18h；

b、采用渗漉法，香青兰药材3.0kg与75％乙醇比例1∶35，流速6mL/min，收集乙醇渗漉液；

c、渗漉液用孔径0.1mm的网孔过滤1次，滤液合并；

d、用减压蒸馏装置，在压力：0.09Mpa，温度：60℃下，蒸馏除去乙醇得1.0g/mL的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉410g；

e、将100g浸膏粉采用70％乙醇溶解后干法拌样，上100～200目聚酰胺进行柱层析，采用40～75％乙醇梯度洗脱得到洗脱液共75000mL，并收集60～75％乙醇梯度的洗脱液35000mL，每个梯度洗脱液为4倍量柱体积；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.1Mpa，温度：50℃下蒸干得浸膏粉9.50g；

f、为了进一步纯化所得浸膏粉，滤去杂质，采用100倍量的95％乙醇对所述浸膏粉进行重结晶，所得制备液用减压蒸馏装置，在压力：0.10Mpa，温度：40℃下蒸干得淡黄色结晶0.49g。

一、结构鉴定：取所得样品分别对UV、IR、MS、NMR进行归峰解谱，确定实施例2所提纯的样品为刺槐素。

二、纯度鉴定：

熔点(mp)测定：263℃～265℃。

薄层色谱检测：采用两种展开体系进行检测，薄层板用聚酰胺薄膜。展开剂A为乙醇-甲酸水(体积比为1∶1)，R_fA为0.34；展开剂B为乙酸乙酯-95％乙醇(体积比为6∶4)，R_fB为0.61，紫外365nm下见黄色斑点，无杂质点。

HPLC检测：用HPLC外标法测定含量，选定260nm和330nm为检测波长。选用乙腈-0.1％磷酸水溶液(80∶20，V/V)为流动相，以刺槐素为对照品。精密称取实施例2制备的淡黄色粉末2.50mg于100mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度线。经Waters分析型高效液相色谱检测，外标法定量，其纯度为99.36％，得率为22.85％。

实施例3：从香青兰中提取分离得到刺槐素的方法，按以下步骤进行：

a、将香青兰干燥的地上部分粉碎，用10倍量的40％乙醇浸泡18h；

b、采用渗漉法，香青兰药材4.0kg与70％乙醇比例1∶35，流速6mL/min，收集乙醇渗漉液；

c、渗漉液用孔径0.1mm的网孔过滤2次，滤液合并；

d、用减压蒸馏装置，在压力：0.1Mpa，温度：60℃下，蒸馏除去乙醇得1.2g/mL的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉550g；

e、将100g浸膏粉采用70％乙醇溶解后干法拌样，上100～200目聚酰胺进行柱层析，采用30～75％乙醇梯度洗脱得到洗脱液共95000mL，并收集60～75％乙醇梯度的洗脱液40000mL，每个梯度洗脱液为4.5倍量柱体积；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.1Mpa，温度：50℃下蒸干得浸膏粉10.3g；

f、为了进一步纯化所得浸膏粉，滤去杂质，采用100倍量的95％乙醇对所述浸膏粉进行重结晶，所得制备液用减压蒸馏装置，在压力：0.10Mpa，温度：60℃下蒸干得淡黄色结晶0.52g。

一、结构鉴定：取所得样品分别对UV、IR、MS、NMR进行归峰解谱，确定实施例3所提纯的样品为刺槐素。

二、纯度鉴定：

熔点(mp)测定：263℃～265℃。

薄层色谱检测：采用两种展开体系进行检测，薄层板用聚酰胺薄膜。展开剂A为乙醇-甲酸水(体积比为1∶1)，R_fA为0.34；展开剂B为乙酸乙酯-95％乙醇(体积比为6∶4)，R_fB为0.61，紫外365nm下见黄色斑点，无杂质点。

HPLC检测：用HPLC外标法测定含量，选定260nm和330nm为检测波长。选用乙腈-0.1％磷酸水溶液(80∶20，V/V)为流动相，以刺槐素为对照品。精密称取实施例2制备的淡黄色粉末2.50mg于100mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度线。经Waters分析型高效液相色谱检测，外标法定量，其纯度为97.89％，得率为24.35％。