本发明涉及新型蛋白转导域及其用途，更加详细地涉及具有序列号1中记载的氨基酸序列的作为一种肽的新型蛋白转导域(ptd：proteintransductiondomain)及其用途。
背景技术：
：：ptd(proteintransductiondomain)是用于传递肽、蛋白质、dna等的肽，由5～30个氨基酸序列构成。ptd与期望穿透的生物学分子(目标物质)的融合简单，不会给生物学分子的结构或功能带来影响，因此，最近在化妆品、药品等领域中备受瞩目。首次公开了在ptd系列中由hiv衍生出的tat蛋白质的48～60号氨基酸序列具有细胞穿透序列，能够向细胞内传递各种生物学物质。之后，随着明确细胞内穿透过程中的起电，开始制作很多带负电荷的细胞膜可稳定地附着的正离子系列的序列。到目前为止已经公开的ptd大体分为三种，即(i)两亲性肽(transportan、pep1、mpg、pvec、map、cady)、(ii)正离子肽(polyarginine、tat、penetratin、p22n)以及(iii)疏水性肽(k-fgf、c105y)。两亲性和正离子肽已经公开有很多，但是，疏水性肽因其序列并不是人为合成的，所以到目前为止公开的肽的数量还是非常有限的。ptd能够实现生物学分子无法通过的细胞穿透，其通过细胞膜的糖胺聚糖(glycosaminoglycan、gag)进入细胞内，除此之外还可以通过入胞通道流入。ptd和生物学物质(例如，sirna、核酸、小分子、蛋白质、细胞毒性药物、显像剂等)之间的结合可通过包括共价键、离子键、静电吸引力等在内的各种手段实现。与现有的传递载体(例如，脂质体、聚合物等)相比，ptd的重要的优点在于为了治疗或诊断，向细胞内传递生物学分子时，毒性较低，对治疗的免疫排斥反应少。由此，可通过阶段性处理方法来改善高浓度的处理方法带来的问题。但是，目前临床中使用的ptd还是非常少，由病毒衍生出的ptd中还存在给免疫反应带来影响等问题，所以迫切需要发掘出不是从病毒衍生且传递效率较高的传递载体。现有技术文献专利文献(专利文献1)韩国专利公开号第10-2014-0122380号(公开日：2014.10.20)中记载了“包含tctp-ptd的基因传递载体”。(专利文献2)韩国专利公开号第10-2008-0113759号(公开日：2008.12.31)中记载了“新型蛋白质转导域及其用途”。技术实现要素：要解决的问题本发明的目的在于开发并提供目标物质的传递效率高且明显降低各种副作用的新的ptd(proteintransductiondomain)。解决问题的手段本发明提供一种肽，其具有序列号1中记载的氨基酸序列。此时，优选地，上述序列号1的氨基酸序列可被编码为序列号2中记载的核酸序列。并且，上述肽可以是例如蛋白转导域(proteintransductiondomain，ptd)。并且，上述肽可以是例如基因传递载体。另外，本发明提供一种结合体，该结合体是将可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质化学结合于序列号1中记载的氨基酸序列而形成的。此时，优选地，上述化学结合可以是共价键结合或者非共价键结合。作为一例，可进行共价键结合的上述物质可以是肽或者蛋白质。并且，作为一例，上述非共价键结合可以是离子键结合或者通过静电吸引力的结合或者通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)的结合。并且，作为一例，可通过离子键或者静电吸引力结合的上述物质可以是带电荷的物质，作为一例，上述带电荷的物质可以是dna或者rna。另外，本发明提供一种复合体，该复合体混合有可通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质和序列号1中记载的氨基酸序列。此时，作为一例，可通过静电吸引力结合的上述物质可以是带电荷的物质，作为一例，上述带电荷的物质可以是dna或者rna。另外，本发明提供一种包含结合体或者复合体的化妆品组合物，其中该结合体是将可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质结合于序列号1中记载的氨基酸序列而形成的，该复合体混合有可通过疏水性相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质和序列号1中记载的氨基酸序列。另外，本发明提供一种包含结合体或者复合体的药物组合物，其中该结合体是将可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质结合于序列号1中记载的氨基酸序列而形成的，该复合体混合有可通过疏水性相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质和序列号1中记载的氨基酸序列。另外，本发明提供一种可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质的细胞内导入方法，特征在于，将具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽结合于可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质，而将可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质导入细胞内。另外，本发明提供可通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质的细胞内导入方法，特征在于，将具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽与可通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质进行混合，而将可通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质导入细胞内。发明效果将本发明的具有序列号1中记载的肽用作ptd时，具有能够简单地将蛋白质、肽、dna等生物学分子(目标物质)导入细胞内且成品率高的优点。附图说明图1是一般的gfp表达载体的图谱。图2是tat-gfp表达载体的图谱。图3是pep1-gfp表达载体的图谱。图4是step-gfp表达载体的图谱。图5是gfp重组蛋白质的表达结果。图6是gfp重组蛋白质的纯化结果。图7是gfp蛋白质的细胞穿透力的对比结果。图8是gfp蛋白质的皮肤穿透力的对比结果。图9是pep1-egf表达载体的图谱。图10是step-egf表达载体的图谱。图11是egf重组蛋白质(pep1-egf、step-egf)的表达结果。图12是egf重组蛋白质(pep1-egf、step-egf)的纯化结果。图13是egf重组蛋白质的细胞增殖功效结果(egf、pep1-egf、step-egf)。图14是egf蛋白质的皮肤穿透力的对比结果。图15是细胞穿透性肽的细胞毒性的确认结果。图16是细胞穿透性肽-fitc混合物的‘细胞’穿透力的对比结果。图17是细胞穿透性肽-fitc混合物的‘皮肤’穿透力的对比结果。图18是细胞穿透性肽和fitc-ddbd混合物的‘细胞’穿透力的对比结果。图19是细胞穿透性肽和fgf2混合物的皮肤穿透力的对比结果。具体实施方式在整个说明书中参照了多个论文以及专利文献，并且标注了引用部分。被引用的论文以及专利文献中公开的内容作为一个整体以被参照的内容插入本说明书中，能够更加清楚地说明本发明所属
技术领域：
：的水平以及本发明的内容。本发明的发明人为了研发能够将目标物质传递至细胞内的更加有效的肽以及利用该肽的药物传递系统(drugdeliverysystem)，经过努力，研发出序列号1中记载的细胞穿透肽。经过确认，序列号1中记载的肽具有两亲性特性，能够有效地适用于目标物质向细胞内的传递，从而完成了本发明。根据上述结果，本发明提供具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽。此时，优选地，上述序列号1的氨基酸序列可编码为序列号2中记载的核酸序列。并且，根据使用目的，本氨基酸序列的n-末端或者c-末端可结合用于实现所需目的的肽。本发明的序列号1中记载的肽可用作蛋白转导域(proteintransductiondomain，ptd)或者基因传递载体。另外，本发明提供一种结合体，该结合体是将可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质化学结合于序列号1中记载的氨基酸序列而形成的。‘化学结合’是包括所有的化学性结合的概念，例如，可以是共价键结合或者非共价键结合。作为一例，共价键结合是指通过在本发明的序列号1中记载的氨基酸序列的n-末端或者c-末端结合肽从而能够变成目标物质(导入细胞或者皮肤内的对象物质)。此时，目标物质可以是在细胞内能够发挥特定目的、例如皮肤美容功效的肽或者蛋白质、发挥医药功效的肽或者蛋白质。作为肽，可以是例如dipeptidediaminobutyroylbenzylamidediacetate(产品名称：syn-ake)、acetylhexapeptide-8(产品名称：argireline)等。作为蛋白质，可以是例如egf(epidermisgrowthfactor)、fgf1(fibroblastgrowthfactor-1)、fgf2(fibroblastgrowthfactor-2)、sod1(superoxidedismutase-1)、cat(catalase)、(fk506bp：fk506-bindingprotein)、bont/alightchain(botulinumneurotoxintypealightchain)等。另外，在本发明的结合体中，作为一例，上述非共价键结合可以是离子键结合或者通过静电吸引力的结合或者通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)的结合。通过离子键或静电吸引力或疏水相互作用，多种生物学物质(例如，sirna、核酸、小分子、蛋白质、细胞毒性药物、显像剂等)结合于本发明的序列号1中记载的肽，从而被导入细胞或者皮肤内。作为一例，可通过离子键或者静电吸引力结合的上述物质可以是带电荷的物质，作为一例，可以是dna或者rna。另外，本发明提供一种复合体，该复合体混合有可通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质和序列号1中记载的氨基酸序列。经确认，根据本发明，仅靠混合，而不诱导人为的化学结合，即可将可通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于本发明的序列号1中记载的肽的目标物质通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于本发明的序列号1中记载的肽，而可以导入细胞内或者皮肤内。此时，作为一例，可通过静电吸引力结合的上述物质可以是带电荷的物质，作为一例，上述带电荷的物质可以是dna或者rna。另外，本发明提供一种包含结合体或者复合体的化妆品组合物，其中该结合体是将可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质结合于序列号1中记载的氨基酸序列而形成的，该复合体混合有可通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质和序列号1中记载的氨基酸序列。下面的本发明的实验结果表明，当制备成本发明的结合体或者复合体时，具有出色的皮肤穿透效果。本发明的化妆品组合物并不限定于特定的方式(剂型)，包括所有的剂型，作为一例，优选地，选自化妆水、啫喱、水溶性液体、面霜、精华液、水包油(o/w)形以及油包水(w/o)形乳液、软膏构成的基础化妆品剂型、水包油形以及油包水形粉底、粉底霜、遮盖霜、口红、唇彩、粉饼、双效粉饼、眼影、腮红以及眉笔类构成的彩妆剂型中的任意一种。并且，本发明的化妆品组合物可以包含化妆品领域中常用的助剂、例如亲水性或者亲油性凝胶剂、亲水性或者亲油性活性剂、保鲜剂、抗氧化剂、溶剂、芳香剂、填充剂、阻滞剂、颜料、吸收剂以及染料。另外，本发明提供一种包括结合体或者复合体的药物组合物，其中该结合体是将可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质结合于序列号1中记载的氨基酸序列而形成的，该复合体混合有可通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质和序列号1中记载的氨基酸序列。本发明的药物组合物并不限定于特定的剂型，包括所有的剂型，具体的剂型可以是选自例如硬膏剂(plasters)、颗粒剂(granules)、洗剂(lotions)、搽剂(liniments)、柠檬水(lemonades)、芳香水剂(aromaticwaters)、散剂(powders)、糖浆剂(syrups)、眼用软膏(ophthalmicointments)、液剂(liquidsandsolutions)、气雾剂(aerosols)、浸膏剂(extracts)，酏剂(elixirs)、软膏剂(ointments)、流浸膏剂(fluidextracts)、乳剂(emulsions)、混悬剂(suspensions)、汤剂(decoctions)、浸剂(infusions)、滴眼剂(ophthalmicsolutions)、片剂(tablets)、栓剂(suppositories)、注射剂(injections)、醑剂(spirits)、泥罨剂(cataplsma)、胶囊剂(capsules)、乳青剂(creams)、锭剂(troches)、酊剂(tinctures)、糊剂(pastes)、丸剂(pills)、软质或者硬质明胶胶囊的任意一种。并且，优选地，本发明的药物组合物还可以包含医药学上允许的载体、稀释剂或者赋形剂。作为可使用的载体、赋形剂或者稀释剂，例如有乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸，明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟苯酸酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟苯酸酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁以及矿物油，可以使用选自其中的一种以上。另外，本发明提供一种可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质的细胞内导入方法，特征在于，将具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽结合于可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质，而将可与具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽进行化学结合的物质导入细胞内。并且，本发明提供一种可通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质的细胞内导入方法，特征在于，将具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽与可通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质进行混合，而将可通过疏水相互作用(hydrophobicinteraction)或者静电吸引力结合于具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽的物质导入细胞内。通过本发明的方法，能够将期望导入细胞内的目标物质简单地导入细胞内且成品率高。此时，除了本发明的具有序列号1中记载的氨基酸序列的肽之外，将目标物质导入细胞内所需的技术可以采用本领域的公知技术。如上所述的本发明表明，通过由序列号1中记载的27个氨基酸序列构成的肽，可以实现细胞穿透，能够传递蛋白质以及基因。并且，其效率根据传递物质的位置有所不同，所以本发明将成为公开了利用ptd有效地传递物质的方法的基础资料。并且，本发明的序列号1中记载的肽具有通过简单的混合也可以传递物质的优点，将有效地用作传递载体。以上，详细说明了本发明的内容的特定部分，本领域技术人员应该可以理解，这些具体说明只是一个实施例，本发明的保护范围并不限定于这些。因此，本发明的实质性保护范围应该基于权利要求书及其等同物来确定。[实施例1.细胞及皮肤穿透性gfp蛋白质表达载体的制备]为了能够简单地将巨大分子蛋白质或者肽导入细胞及皮肤内，融合了具有细胞及皮肤穿透能力的肽和期望传递的蛋白质(cargo)，制备了重组蛋白质表达载体。在本实施例中，为了简单地分析传递能力、即这样的融合蛋白质中能够传递至细胞及皮肤的有多少，作为期望传递的目标蛋白质(cargo)，选择了绿色荧光蛋白质(greenfluorescenceprotein、下面简称为gfp)。将目前已经公开的ptd即tat或者pep1融合于gfp，并且与本发明中新研发的step(序列号1)对比了细胞及皮肤内传递能力。(1)pgfp载体的制备将相当于gfp的碱基序列的dna切片在质粒pet15b的xhoi、bamhi位置子克隆，制备了表达gfp蛋白质的pgfp。pgfp表达载体中未融合具有细胞及皮肤穿透能力的肽，gfp是约29kda的亲水性高分子蛋白质，所以可以视为该载体所表达的gfp不具有能够传递至细胞及皮肤的能力。因此，制备成用于对比细胞及皮肤穿透性的对照组。利用质粒pegfp-c2(clonetek)，使用pfudna聚合酶，对相当于gfp的碱基序列的dna切片进行聚合酶链式反应(pcr)，对gfp的整个序列进行了放大。正义引物(senseprimer)是5'-ctcgaggtgagcaagggcgaggagctg-3'，反义引物(antisenseprimer)的序列是5'-ggatccttacttgtacagctcgtccatgccgag-3'。pcr产物按照xhoi-bamhi进行切割，在pet15b(invitrogen，carlsbad，ca)的xhoi–bamhi位置子克隆，从而制备了通常的表达gfp蛋白质的pgfp。图1是通常的gfp表达载体的图谱。(2)ptat-gfp载体的制备按照如下方法制备了表达与hiv-1tat融合的gfp的ptat-gfp。首先，制备两个寡核苷酸，被合成为对hiv-1tat的9个氨基酸进行编码的双链寡核苷酸。对hiv-1tat的9个氨基酸进行编码的序列是上侧链5'-taggaagaagcggagacagcgacgaagac-3'和下侧链5'-tcgagtcttcgtcgctgtctccgcttcttcc-3'。双链寡核苷酸被直接子克隆成pgfp的ndei-xhoi，从而制备了表达tat-gfp蛋白质的ptat-gfp。图2是tat-gfp表达载体的图谱。(3)ppep1-gfp载体的制备按照如下方法制备了表达融合有pep1的gfp的ppep1-gfp。首先，两个寡核苷酸的上侧链5'-tatgaaagaaacctggtgggaaacctggtggaccgaatggagccagccgaaaaaaaaacgtaaagtgc-3'和下侧链5'-tcgagcactttacgtttttttttcggctgagaccattcggtccaccaggtttcccaccaggtttctttcc-3'被合成，得到了对pep1肽进行编码的双链寡核苷酸。双链寡核苷酸直接被子克隆成pgfp的ndei–xhoi，从而制备了表达pep1-gfp蛋白质的ppep1-gfp。图3是pep1-gfp表达载体的图谱。(4)pstep-gfp载体的制备按照如下方法制备了表达融合有本发明的step的gfp的pstep-gfp。首先，两个寡核苷酸的上侧链5'-tatgaaagaaacctggtgggaaacctggtggaccgaatggtcccagccgtatggccgtaaaaaacgtcgtcagcgtcgtcgtc-3'和下侧链5'-tcgagacgacgacgctgacgacgttttttacggccatacggctgggaccattcggtccaccaggtttcccaccaggtttctttcc-3'被合成，得到了对step肽进行编码的双链寡核苷酸。双链寡核苷酸直接被子克隆成pgfp的ndei-xhoi，从而制备了表达step-gfp蛋白质的pstep-gfp。图4是step-gfp表达载体的图谱。[实施例2.gfp重组蛋白质的表达]在本实施例中，从上述实施例中制备的重组载体表达对应的蛋白质。将4种表达载体分别转化至e.colirosetta-gami2(de3)细胞内。利用包含氨苄青霉素的1,000ml的lb培养基，在37℃下培养了被转化的细菌细胞，直到od600值达到0.6为止，在22℃下导入0.5mmiptg，进一步培养24小时，从而诱导了gfp蛋白质的表达。获得添加iptg带来的目标蛋白质的诱导表达前后的培养细胞，进行sds-page电泳之后，利用考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue)对蛋白质进行染色，从而观察并确认了是否有各个gfp蛋白质表达。其结果为，如图5示出，gfp表达出29.35kda的大小的蛋白质，tat-gfp表达出30.54kda的大小的蛋白质，pep1-gfp表达出32.18kda的大小的蛋白质，step-gfp表达出32.95kda的大小的蛋白质。图5是gfp重组蛋白质的表达结果。[实施例3.gfp重组蛋白质的纯化]在本实施例中，对在上述实施例中分别表达的蛋白质进行细胞破碎工序之后，利用histag亲和柱，仅分离出gfp蛋白质，进行纯化。关于对4种gfp蛋白质的纯化方法，如下所述地利用相同方法进行了纯化。将pet15-gfp、ptat-gfp、ppep1-gfp、pstep-gfp转化细胞在1xnative缓冲液(50mmnapo4，0.5mnacl)中利用超声波设备进行粉碎后，对其进行离心分离，分成内涵体(inclusionbody)和细胞质(上清液)。4种gfp蛋白质均有his6标签(tagging)，所以利用该特性，将细胞破碎后进行离心分离分离出的各上清液利用ni2+-nta亲和柱(nitrilotriaceticacidsepharoseaffinitycolumn，gehealthcare，usa)进行了纯化。色谱柱的平衡以及gfp蛋白质的结合使用了1xnative缓冲液，并且制备了1xnative缓冲液的各种浓度的咪唑(imidazole)，用于洗涤(washing)和洗脱(elution)。对于分离并纯化后的gfp蛋白质，利用稳定化缓冲液(50mmnapo4，0.1mnacl，10％glycerol，ph7.5)进行了透析。在此，将所得到的最终产物分别命名为gfp、tat-gfp、pep1-gfp、step-gfp。图6是gfp重组蛋白质的纯化结果。[实施例4.细胞及皮肤穿透性gfp蛋白质的细胞穿透分析]在本实施例中，为了对比上述实施例中纯化的4种gfp蛋白质的细胞穿透能力，利用gfp绿色荧光在hacat(humankeratinocyte)细胞观察了细胞内穿透。将hacat(humankeratinocyte)细胞在培养用玻片(slide)上培养了24小时。之后，去除培养基，利用hbss洗涤三次之后，将gfp以及细胞穿透性gfp蛋白质(pep1-gfp、tat-gfp、step-gfp)处理在细胞。处理在细胞时，制备各自的蛋白质浓度为10mm的母液(stock)，在培养基中稀释成1/10，处理成最终达到10μm，之后培养2小时。2小时后去除培养基，利用pbs，洗涤细胞之后，利用冷却甲醇，在-20℃下固定细胞10分钟。利用pbs充分洗涤细胞之后，向pbs投入稀释成1/5000的核染色试剂(dapi)，在避光状态下，进行了10分钟的染色。利用pbs充分洗涤，封片(mounting)后，利用激光扫描共聚焦显微镜进行了分析。其结果为，step-gfp蛋白质处理组的细胞内绿色荧光最亮，从而可以得知step大幅提高细胞内穿透效果。图7是gfp蛋白质的细胞穿透力的对比结果。[实施例5.细胞及皮肤穿透性gfp蛋白质的皮肤穿透分析]为了了解除了细胞之外，在皮肤中step是否提高gfp蛋白质的穿透，利用了弗朗兹细胞(franzcell，直径9mm)。在细胞的上端与下端之间安装猪皮(厚度0.7mm，medikinetics)，在其上端处理了50μmgfp蛋白质300μl。24小时后，取出猪皮，利用pbs洗涤三次。洗涤之后，在低温模具(cryomold)处理oct包埋基体(octembeddingmatrix，cellpathltd.，uk)，在-70℃下冻结了组织。利用低温切片机(cryotome，hm520，germany)在-20℃下将冻结组织横切(cross-section)成7μm厚度，从而制备了切片玻片。对于为了对皮肤细胞的核进行染色而固定在载玻片(slideglass)上的组织切片，向pbs投入被稀释成1/5000的核染色试剂(dapi)，在避光状态下，进行10分钟的染色之后，利用pbs洗三次。封片(mounting)后，利用激光扫描共聚焦显微镜进行了分析。实验结果可确认，gfp未传递至猪皮组织内，与此相反，本发明的step-gfp能够有效地传递至皮肤内。图8是gfp蛋白质的皮肤穿透力的对比结果。在图8中，‘lut图像’是利用lut(lookuptable)加大对比度的图像。[实施例6.细胞及皮肤穿透性egf蛋白质表达载体的制备]虽然为了简单地观察step的细胞及皮肤穿透能力从而利用了gfp蛋白质，但是为了说明step的效果并不限定于gfp，作为另一实施例，在表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)融合step，从而制备重组蛋白质表达载体。表皮细胞生长因子是促进表皮细胞的细胞分裂的荷尔蒙，是具有53个氨基酸残基的肽，其分子量是6,200道尔顿。表皮细胞生长因子是具有在生理作用中起到必要功能的三个二硫键(disulfidebonds:cys6-cys20、cys14-cys31、cys33-cys42)的肽蛋白质。总所周知，表皮细胞生长因子是在体内发挥表皮细胞的增殖以及出现创伤时治愈伤口的作用的因子。总所周知，表皮细胞生长因子对包括表皮细胞和间叶(messenchymal)细胞在内的各种细胞具有促进类似分裂、促进细胞生长以及抑制胃酸分泌等活性，从而可以用作皮肤或者角膜的创伤治疗制剂或者胃溃疡治疗制剂。将pep1和step分别融合在egf，与新研发出的step对比细胞增殖功效以及皮肤内传递能力。(1)ppep1-egf载体的制备为了制备皮肤穿透性人表皮细胞生长因子(humanepidermalgrowthfactor；rhegf)，制备了人表皮细胞生长因子融合蛋白质表达载体。制备了用于人表皮细胞生长因子和pep1(ketwwetwwtewsqpkkkrkv)肽的融合蛋白质表达的蛋白质表达载体。作为人表皮细胞生长因子，基于cdna序列，合成出两个引发体。正义(sense)引发体5'-acactcgagaatagtgactctgaatgtc-3'包含xhoⅰ限制酶切割部位，反义引发体5'-tgtggatccttagcgcagttcc-3'具有bamhⅰ限制酶切割部位。进行聚合酶链式反应(pcr)，将聚合酶链式反应生成物连接在ta-克隆载体。之后，切割成xhoⅰ和bamhⅰ，对被切割的寡核苷酸进行了洗脱(invitek，berlin,german)。利用t4dna连接酶(takara，otsu，shiga，japan)，将上述被切割的寡核苷酸连接于pet15b载体，转化到e.colidh5细胞。从转化后的细菌纯化了pegf载体。合成上侧链5'-ggggaattccatatgaaagaaacctggtgggaaacctggtggaccgaatggtctcagccgaaaaaaaaacgtaaagtgcctcgagtatat-3'和下侧链(bottomstrand)5'-atatactcgaggcactttacgtttttttttcggctgagaccattcggtccaccaggtttcccaccaggtttctttcatatggaattcccc-3'，对其进行退火处理，从而得到的对pep-1肽进行编码的双链寡核苷酸。双链寡核苷酸直接子克隆为pegf的ndei-xhoi，从而制备了表达pep1-egf蛋白质的ppep1-egf。图9是pep1-egf表达载体的图谱。(2)pstep-egf载体的制备按照下面的方法制备了表达融合有step的egf的pstep-egf。首先，两个寡核苷酸上侧链5'-tatgaaagaaacctggtgggaaacctggtggaccgaatggtcccagccgtatggccgtaaaaaacgtcgtcagcgtcgtcgtc-3'和下侧链5'-tcgagacgacgacgctgacgacgttttttacggccatacggctgggaccattcggtccaccaggtttcccaccaggtttctttcc-3'合成，从而得到对step肽进行编码的双链寡核苷酸。双链寡核苷酸直接子克隆成pegf的ndei-xhoi，从而制备了表达step-egf蛋白质的pstep-egf。图10是step-egf表达载体的图谱。[实施例7.egf重组蛋白质的表达(pep1-egf、step-egf)]在本实施例中，从上述实施例中制备的重组载体表达出对应的蛋白质。为了与细胞及皮肤穿透性egf(pep1-egf、step-egf)对比功效以及效果，使用了市场上销售中的一般的egf，在本实施例中，未进行载体的制备以及表达、纯化。市场上销售中的一般的egf是约6kda的蛋白质，不具有传递至细胞及皮肤的能力。将两种表达载体分别转换至e.colibl21(de3)细胞内。利用包含氨苄青霉素1,000ml的lb培养基，在37℃，培养被转化的细菌细胞，直到od600值达到0.6，并且导入0.5mmiptg，在37℃下进一步培养8小时，从而诱发了pep1-egf以及step-egf蛋白质的表达。获得添加iptg带来的目标蛋白质的诱导表达前后的培养细胞，进行sds-page电泳之后，利用考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue)对蛋白质进行染色，从而观察并确认了是否有各个egf蛋白质表达。其结果，如图11示出，pep1-egf表达出11.9kda的大小的蛋白质，step-egf表达出12.4kda的大小的蛋白质。图11是egf重组蛋白质(pep1-egf、step-egf)的表达结果。[实施例8.egf重组蛋白质的分离纯化(pep1-egf、step-egf)]在本实施例中，对在上述实施例中分别表达的蛋白质进行细胞破碎工序之后，利用histag亲和柱，仅分离出作为目标的pep1-egf以及step-egf蛋白质，进行纯化。关于对两种egf蛋白质的纯化方法，如下所述地利用相同方法进行了纯化。将对ppep1-egf，pstep-egf转化细胞进行细胞培养以及表达从而回收的菌体在50mmtris缓冲液(50mmtris，0.5mnacl，2％tritonx-100，ph8.0)中利用超声波设备进行粉碎后，对其进行离心分离，分成内涵体(inclusionbody)和细胞质(上清液)。两种egf蛋白质以内涵体方式表达，通过细胞破碎后的离心分离，目标蛋白质的大部分包含在内涵体中。因此，为了分离并纯化目标蛋白质，需要利用8m尿素缓冲液进行增溶(solubilization)。并且，两种egf蛋白质均有his6标签(tagging)，所以利用该特性，将被增溶的各egf试料利用ni2+-nta亲和柱(nitrilotriaceticacidsepharoseaffinitycolumn，gehealthcare，usa)进行纯化。通过细胞破碎处理后离心分离回收的每个内涵体是通过包含8m尿素的50mmtris缓冲液(50mmtris，8murea，ph8.0)增溶，从而，通过离心分离，被分为未被增溶的杂质和包含各egf蛋白质的上清液。对于包含各egf蛋白质的上清液，利用ni2+-nta亲和柱(nitrilotriaceticacidsepharoseaffinitycolumn，gehealthcare，usa)，进行了纯化。色谱柱的平衡以及egf蛋白质的结合使用了50mmtris缓冲液(50mmtris，8murea，ph8.0)，并且制备了色谱柱的平衡以及结合用缓冲液的各种浓度的咪唑(imidazole)，用于洗涤和洗脱。将分离并纯化后得到的蛋白质分别命名为pep1-egf、step-egf。[实施例9.egf重组蛋白质的复性以及hplc纯化(pep1-egf、step-egf)]对于分离并纯化的两种蛋白质进一步进行了复性(refolding)工序，以使其具有活性。关于两种egf蛋白质的复性方法，如下所述地利用相同方法进行了复性。利用复性还原缓冲液(50mmna2co3，1mml-cysteine，ph9.6)，在搅拌器将分离并纯化后的各蛋白质稀释10倍，在25℃下，进一步使其反应1小时。接着，为了复性氧化，添加l-胱氨酸(l-cystine)使得最终达到5mm，利用搅拌器，在4℃下反应15小时。对结束反应的复性溶液进行离心分离，从而去除了复性过程中产生的沉淀物，将得到的复性上清液浓缩后，进行了hplc纯化。对于复性后浓缩的各egf蛋白质，利用6mhcl进行酸化(ph2.7～ph3.0)之后，利用0.2μm过滤器进行过滤，从而准备了试料，并利用mplc进行了第一次纯化。作为移动相，使用了放入0.1％三氟乙酸(tfa)(v/v)的水和乙腈(acn)，色谱柱使用了c1840g试剂盒(cartridge)。按照逐渐增加乙腈(acn)浓度的梯度(gradient)方法，利用uv检测仪进行纯化，并收集了利用hplc进行分析的结果为相对于与pep1-egf以及step-egf相应的峰值(peak)的纯度在50％～80％的部分，利用旋转蒸发仪(rotaryevaporator)进行了浓缩。并且，为了获得95％以上的高纯度pep-egf以及step-egf蛋白质，利用hplc进一步进行了二次纯化。hplc作为移动相使用了放入0.1％三氟乙酸(tfa)(v/v)的水和乙腈(acn)，色谱柱使用了c1850×250㎜。按照逐渐增加乙腈(acn)浓度的梯度方法，利用uv检测仪，得到了纯度在95％以上的部分，浓缩后利用稳定化缓冲液(50mmna2co3，10％glycerol，ph9.6)进行了透析。图12是egf重组蛋白质(pep1-egf、step-egf)的纯化结果。[实施例10.egf重组蛋白质的细胞增殖活性的测量(pep1-egf、step-egf)]为了测量egf、pep1-egf以及step-egf的细胞增殖效果，对于小鼠成纤维细胞(balb/c3t3clonea31cells)，按照各种浓度分别处理各纯化的蛋白质，并测量了细胞的生长率。小鼠成纤维细胞在生长培养基培养24小时，在无血清培养基中饥饿(starvation)20小时后，按照各种浓度分别处理各重组蛋白质之后，培养24小时，更加详细地，在装有10％bcs的每100μl的dmem培养基(生长培养基)，向96孔板投放104个/well的balb/c3t3clonea31cells，培养24小时后，转移到0％bcs培养基(无血清培养基)，饥饿(starvation)20个小时左右。之后，将egf、pep1-egf、step-egf蛋白质从最大浓度90ng/ml起各稀释3倍，分别投入well中进行了24小时的处理。最终测量方法中采用了wstassay(takara，otsu，shiga，japan)产品，具体方法是按照产品说明书进行的，将显示ed50(50％effectivedose)浓度的吸光度的蛋白质处理浓度设定为1unit而进行了定量。其结果可以得知对于纯化的egf、pep1-egf以及step-egf，显示出6x106unit/mm以上的细胞增殖活性。尤其是，与egf相比，pep1-egf、step-egf的细胞增殖活性更加优秀，由此可以得知即使是与ptd融合状态，也能够与细胞内的egf受体结合。图13是egf重组蛋白质的细胞增殖功效结果(egf、pep1-egf、step-egf)。表1egf重组蛋白质的细胞增殖活性unit值[实施例11.细胞及皮肤穿透性egf蛋白质的皮肤穿透分析]为了分析通过组织染色的step-egf的皮肤穿透性，对利用猪皮(porcineskin)的弗朗兹细胞(franzcell)处理了相同的量(42um)的normalegf和pep1-egf、step-egf。24小时后，取出弗朗兹细胞(franzcell)之间的猪皮，在蒸馏水中洗涤后进行了组织染色过程。切取暴露在供体细胞(donorcell)的猪皮部位，在10％缓冲甲醛(bufferedformalin)中进行固定后，制备了石蜡块(paraffinblock)，利用显微镜用薄片切片机(microtome)，将组织分成(section)7μm。之后，将组织封片(mounting)在玻片之后去除石蜡，经过水合过程后，将组织切片封闭(blocking)30分钟。对结束封闭(blocking)的组织处理anti-egf抗体(santacruz、green)，在4℃下反应18小时。第二天，用pbst洗涤，将alexafluor488二次抗体在常温下处理2小时，并用pbst再次洗涤一次。之后，为了对比染色，通过hoechst33342(blue)在常温下反应10分钟之后，装入荧光培养基(fluorescencemedium)，用荧光显微镜观察。实验结果可确认，只有在角质层能观察到egf，而pep1-egf在表皮层也能看到。可以得知本发明的step-egf比pep1-egf更加有效地传递到皮肤内。图14是egf蛋白质的皮肤穿透力的对比结果。[实施例12.肽的合成]本发明的发明人为了确认通过细胞穿透性肽和目标物质之间的非共价键结合可提高细胞穿透能力，合成了细胞穿透性肽。分别合成了目前已经得知通过非共价键结合提高细胞穿透能力的pep1肽和新型细胞穿透性肽step。委托肽制造商，安装液相固相法合成了肽，其序列如下表2示出。表2肽氨基酸序列ptd氨基酸序列pep1ketwwetwwtewsqpkkkrkvcstepketwwetwwtewsqpygrkkrrqrrrc[实施例13.细胞穿透性肽的细胞毒性确认]为了确认本发明的肽在生物体内的高分子中传递时是否能够在无害状态下使用，确认了细胞毒性。将2.5×104的包含10％fbs的dmem培养基中培养的hacat细胞转入96孔板，培养24小时后用hbss洗涤两次。将作为细胞穿透性肽的pep1和step分别以50μm、100μm、200μm的浓度溶解在d.w，并且在培养基进行稀释，使最终浓度达到2.5μm、5μm、10μm，并处理在细胞，在37℃下，在5％co2孵化器中反应24小时。培养后，去除上层液，将wst溶液在培养基中稀释成1:9比率，并处理在细胞。培养3小时后，在450nm测量了吸光值，对肽非处理群的细胞和处理群的细胞进行对比，计算出细胞生存率。其结果，如图15示出，pep1和step在10μm的浓度下均未显示出细胞毒性。图15是细胞穿透性肽的细胞毒性的确认结果。[实施例14.细胞穿透性肽-fitc混合物的细胞穿透分析]在本实施例中，为了简单地分析细胞穿透性肽在与目标物质的非共价键结合的状态下传递到细胞内的能力，选择绿色荧光蛋白质(fluoresceinisothiocyanate、下面简称为fitc)作为目标物质。将fitc和细胞穿透性肽(pep1、step)溶解在硼砂缓冲液(boraxbuffer，ph8.0)中而准备。混合过程是将fitc和细胞穿透性肽(pep1、step)以1:0、1:1、1:2的摩尔比混合后在37℃下反应30分钟，最终将5μm细胞穿透性肽-fitc混合物处理在细胞。将混合物处理在细胞之后，培养了1小时30分钟，添加与混合物相同量的培养基，进一步培养了30分钟。30分钟之后，去除培养基，利用pbs洗涤细胞之后，利用甲醇，在-20℃下将细胞固定10分钟。将细胞用pbs充分洗涤之后，向pbs放入稀释成1/5000的核染色试剂(dapi)，避光状态下，进行10分钟的染色。用pbs充分洗涤，封片(mounting)后利用激光扫描共聚焦显微镜进行了分析。其结果发现，处理了step-fitc混合物的组的绿色荧光最亮，与1:1相比，1:2摩尔比时更亮。即、与pep1相比，step的fitc细胞内穿透力更高。图16是细胞穿透性肽-fitc混合物的细胞穿透力的对比结果。[实施例15.细胞穿透性肽-fitc混合物的皮肤穿透分析]为了了解除了细胞之外，在皮肤中以与step的非共价键结合的状态下是否也可以提高fitc的穿透，利用了弗朗兹细胞(franzcell，直径9mm)。将fitc和细胞穿透性肽(pep1、step)溶解在硼砂缓冲液(boraxbuffer，ph8.0)中准备。将混合的fitc和细胞穿透性肽(pep1、step)以1:0、1:2的摩尔比混合后，在37℃下，反应30分钟，最终将100μm细胞穿透性肽-fitc混合物在弗朗兹细胞上端处理200μl。24小时后，取出猪皮，用pbs洗涤三次。洗涤后，在低温模具(cryomold)处理oct包埋基体(octembeddingmatrix，cellpathltd.，uk)，在-70℃下冻结了组织。利用低温切片机(cryotome，hm520，germany)在-20℃下将冻结组织横切(cross-section)成7μm厚度，从而制备了切片玻片。对于为了对皮肤细胞的核进行染色而固定在载玻片(slideglass)上的组织切片，向pbs投入被稀释成1/5000的核染色试剂(dapi)，在避光状态下，进行10分钟的染色之后，利用pbs洗三次。封片(mounting)后，利用激光扫描共聚焦显微镜进行了分析。其结果发现，fitc只位于猪皮角质层，相反，本发明的step-fitc混合物可以有效地传递到皮肤内。图17是细胞穿透性肽-fitc混合物的皮肤穿透力的对比结果。[实施例16.细胞穿透性肽-(dipeptidediaminobutyroylbenzylamidediacetate)混合物的细胞穿透分析]在本实施例中，确认利用具有皮肤生理活性的肽提高通过皮肤穿透实现的生理活性，从而证明本发明可以用作具有抗皱功效的化妆品的原材料。作为具有皮肤生理活性的肽利用了公知的防止对于肌肉收缩的信号从而有助于抗皱的ddbd(dipeptidediaminobutyroylbenzylamidediacetate，产品名称：syn-ake)。ddbd是模仿巴西蝰蛇毒蛋白(waglerin)1的蛇毒合成的肽。为了简单地分析ddbd的细胞传递能力，合成了连接有fitc的fitc融合ddbd(fitc-ddbd)。为了了解在与step的非共价键结合的状态下是否提高ddbd的细胞内穿透，在balb/3t3(mouseembryonicfibroblastcellline)细胞中利用fitc绿色荧光观察了ddbd的细胞内穿透。balb/3t3细胞在培养用玻片上培养了24小时。之后，去除培养基(dmem+10％bcs，1％antibiotics)后用hbss洗涤三次之后，处理了混合step和fitc-ddbd的混合物。混合是将fitc-ddbd和step以1:5的摩尔比混合后在室温下反应10分钟，最终将10umfitc-ddbd处理在细胞。60分钟后，去除培养基，利用hbss洗涤细胞，之后利用冷却甲醇，在-20℃下固定细胞10分钟。将细胞用pbs充分洗涤后，向pbs投入被稀释成1/5000的核染色试剂(dapi)，在避光状态下，进行10分钟的染色。用pbs充分洗涤后封片(mounting)，利用激光扫描共聚焦显微镜进行了分析。其结果可确认，与仅处理fitc-ddbd的群组相比，混合step后放入fitc-ddbd时，能够进一步提高细胞内穿透性。图18是细胞穿透性肽和fitc-ddbd混合物的‘细胞’穿透力的对比结果。[实施例17.细胞穿透性肽-fgf2混合物的皮肤穿透分析]为了确认除了ddbd等小分子量的肽之外，利用分子量较大的蛋白质时是否可以提高通过皮肤穿透实现的生理活性，利用了fgf2(fibroblastgrowthfactor-2，碱性成纤维细胞生长因子)。总所周知，fgf2通过刺激构成皮肤的角质形成细胞和成纤维细胞，从而再生皮肤以及恢复健康的皮肤状态，但是，由于是高分子亲水性物质，所以难以实现皮肤内穿透。为了分析通过组织染色实现的fgf2的皮肤穿透性，处理了与利用猪皮(porcineskin)的弗朗兹细胞(franzcell)相同的量的(500μg)的fgf2和pep1-fgf2以及step和fgf2混合物。24小时后，取出弗朗兹细胞(franzcell)之间的猪皮，在蒸馏水中洗涤，之后进行了组织染色过程。切取暴露在供体细胞(donorcell)的猪皮部位，在10％缓冲甲醛(bufferedformalin)中进行固定之后，制备了石蜡块(paraffinblock)，利用显微镜用薄片切片机(microtome)，将组织分成(section)7μm。之后，将组织封片(mounting)在玻片上之后去除石蜡，经过水合过程，将组织切片封闭(blocking)30分钟。对结束封闭(blocking)的组织处理anti-fgf2抗体(cellsignaling，green)，在4℃反应18小时。第二天，用pbst洗涤后，在常温下将alexafluor488二次抗体处理2小时，用pbst再洗涤一次。之后，对于组织切片，向pbs投入被稀释成1/5000的核染色试剂(dapi)，在避光状态下，进行10分钟的染色之后，用pbs洗涤三次。封片(mounting)后，利用激光扫描共聚焦显微镜进行了分析。其结果可以得知，fgf2根本没有传递到猪皮组织内，相反，pep1-fgf2有效地传递到猪皮组织的皮肤内。此时，step和fgf2只是简单的混合物，但是，其皮肤传递能力仍然超过pep1-fgf2。图19是细胞穿透性肽和fgf2混合物的‘皮肤’穿透力的对比结果。【序列目录】<110>株式会社百赛转化<120>新型蛋白转导域及其用途<130>yp-16-229<160>2<170>kopatentin3.0<210>1<211>27<212>prt<213>artificialsequence<220><223>proteintransductiondomain,step<400>1lysgluthrtrptrpgluthrtrptrpthrglutrpserglnprotyr151015glyarglyslysargargglnargargargcys2025<210>2<211>81<212>dna<213>artificialsequence<220><223>polynucleotidecodingproteintransductiondomain,step<400>2aaagaaacctggtgggaaacctggtggaccgaatggtcccagccgtatggccgtaaaaaa60cgtcgtcagcgtcgtcgttgt81当前第1页12当前第1页12