本发明涉及化学制药领域，更具体地，涉及一种饲料添加剂恩拉霉素的提纯方法及其应用。
背景技术：
：恩拉霉素(enramycin)是由土壤中分离出来的放线菌streptomycesfungicidiousno.b5477发酵产生的一种由不饱和脂肪酸和十几种氨基酸结合成的多肽类抗生素。其中氨基酸分子构成环状多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端。据其末端脂肪酸种类不同，分为恩拉霉素a和b，恩拉霉素则是由这两种成分组成的混合物。其对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，长期使用后不易产生抗药性，且能改变肠道内的细菌群落分布，有利于饲料营养成份的消化吸收，促进动物增重和提高饲料利用率，因此被世界上许多国家推荐作为抗生素促生长剂。恩拉霉素的发酵过程是一个复杂的微生物代谢过程,恩拉霉素粗产品中副产物众多,因此恩拉霉素粗品的分离纯化工艺较为复杂。现有的恩拉霉素纯化的方法有以下几种：日本武田医药公司采用多孔苯乙烯-二乙烯苯聚合物大孔吸附树脂amberlitexad-2对恩拉霉素样品进行层析，成功的分离出了恩拉霉素a和b组分，同时采用梯度洗脱对恩拉霉素a和b进行定量分析。王丹丹等(大孔树脂分离纯化持久霉素[j].食品与发酵工业,2010,36(4):194-196)采用几种型号大孔树脂提取恩拉霉素实验对比，ab-8大孔树脂提取效果较为理想。以发酵后的菌丝体为原料，经过细胞破碎、恩拉霉素粗提物的制备、大孔树脂的吸附、梯度洗脱和浓缩干燥的过程得到纯度较高的恩拉霉素，再经过葡聚糖凝胶纯化后，恩拉霉素的相对含量可达到95％以上。顾欣等(饲料中恩拉霉素的微生物学含量测定方法研究[j].中国兽药杂志,2008,42(9):17-21)将饲料样品经酸性甲醇溶液提取，并采用大孔吸附树脂amberlitexad-2层析柱吸附洗脱后，使饲料中的恩拉霉素也能到很好的分离纯化。不同的上述方法得到的产品纯度及收率都还有待于进一步提高，且提纯工艺均较为复杂。因此有必要提供一种工艺过程更简便、生产周期更短的恩拉霉素提取工艺，以期推动恩拉霉素应用领域的发展。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种生产工艺简便、生产周期短、环境友好、产率高和纯度高的恩拉霉素提纯方法。本发明提供了一种恩拉霉素的提纯方法，包括：利用酸性丙酮水溶液对恩拉霉素粗品进行浸提，获得恩拉霉素浸提液，再将其蒸馏除去丙酮得到恩拉霉素粗提物，最后除去上清液，烘干即得恩拉霉素精品。优选地，所述酸性丙酮水溶液的ph值为1.5-5；优选为2-4。优选地，使用盐酸将丙酮水溶液调成酸性。优选地，所述丙酮的水溶液中丙酮和水的体积比为0.5-5:1，优选为1-2:1。优选地，所述相对于50g恩拉霉素粗品，所述酸性丙酮水溶液的用量为250ml-1200ml，进一步优选为600ml-1000ml，更优选为700ml-800ml。优选地，所述浸提的温度高于室温且低于丙酮的沸点值，优选为38℃-42℃。优选地，所述浸提的时间为0.5h-5h，优选为1h-2h。优选地，还包括在浸提前将浸提体系在50hz-150hz的超声波下超声混匀0.5h-1h。优选地，还包括在蒸馏之前将所述恩拉霉素浸提液转入振荡器在在150rpm-200rpm下震荡1.5h-2h的步骤。优选地，所述蒸馏采用减压蒸馏的方式，优选在40℃-80℃的水浴条件下进行。优选地，所述提纯方法不包括使用碱调节ph值的步骤。本发明还提供了本发明所述的提纯方法在制备饲料添加剂中的用途。本发明所提供的恩拉霉素提纯方法通过使用酸性丙酮水溶液对恩拉霉素粗品进行提纯得到了纯度较高的恩拉霉素精品，大大减化了现有技术中纯化的工艺步骤，克服了生产周期长、生产过程污染排放多的缺陷，提高了生产过程的效率。菌种保藏信息：bjx002，分类命名为杀真菌素链霉菌streptomycesfungicidious，保藏编号为cgmccno.6026，于2012年04月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。具体实施方式本发明提供了一种恩拉霉素的提纯方法，包括：利用酸性丙酮水溶液对恩拉霉素粗品进行浸提，获得恩拉霉素浸提液，再将其蒸馏除去丙酮得到恩拉霉素粗提物，最后除去上清液，烘干即得恩拉霉素精品。现有技术中的提纯方法中大都包括先用混合溶剂酸洗，后用碱将混合溶液的ph值调成中性，再进行其它冲洗步骤后得到较纯的恩拉霉素精品。现有技术中恩拉霉素不溶于丙酮、苯以及氯仿等溶剂，而本发明创新地选用了酸性丙酮水溶液对粗品进行浸提后，不需要使用碱将混合溶液的来调节ph值，在常规后续步骤后也能得到纯度较高的恩拉霉素精品，减少纯化时间。优选地，所述酸性丙酮水溶液的ph值为1.5-5；更优选为2-4。在该ph值范围内恩拉霉素溶解度达到最大。其中，用于调节丙酮的水溶液的酸选自盐酸、硫酸、甲酸和/或磷酸，为了进一步提高恩拉霉素的纯度，更优选使用盐酸将丙酮的水溶液调成所需酸性。优选地，所述丙酮的水溶液中丙酮和水的体积比为0.5-5:1，更优选为1-2:1。优选地，提纯方法不包括使用碱调节ph值的步骤。由于本发明所述方案后期可以直接利用蒸馏使恩拉霉素析出，故无需使用碱调节ph值，从而可以更好的提高提纯纯度。优选地，相对于50g恩拉霉素粗品，所述酸性丙酮水溶液的用量为250ml-1200ml，进一步优选为600ml-1000ml，更优选为700ml-800ml。在上述用量范围内，本发明所述的提纯方法能够充分溶解恩拉霉素，完成充分有效地浸提。优选地，浸提的温度高于室温且低于丙酮的沸点值，进一步优选为38℃-42℃。浸提时间随粗品中的杂质含量而定，当固体部分的质量没有明显减少时，可停止浸提，通常时间为0.5h-5h，更优选为1h-2h。本发明的一种优选的实施方式中，将酸性丙酮水溶液与恩拉霉素粗品充分接触混合，获得浸提体系，对其进行机械或是人工混匀，通常采用超声混匀，加速其浸提速度，提高浸提效果，优选地，使浸提体系在50hz-150hz的超声波下超声混匀0.5h-1h，而后再将其置于上述恒温体系下浸提。本发明的一种优选的实施方式中，为了该特定体系获得更好的浸提效果，在恒温浸提后将浸提体系转入振荡器在150rpm-200rpm下震荡1.5h-2h。优选的实施方式中，利用减压蒸馏的方式将浸提液中的丙酮去除，优选在40℃-80℃的水浴条件下进行。优选的实施方式中，对恩拉霉素粗提物静置2h-4h离心去上清液得沉淀。优选的实施方式中，对恩拉霉素粗提物的沉淀经40℃-80℃烘干即得恩拉霉素精品。为了进一步提高恩拉霉素的纯度，优选的实施方式中的提纯方法中还包括用纯净水清洗恩拉霉素粗提物沉淀并离心，重复多次，直至离心后上清液为无色透明液体为止，然后再进行烘干步骤。在本发明的实施方式中，本发明所述的恩拉霉素粗品可为市售的已知产品(如可购自浙江海正药业股份有限公司)，合适的恩拉霉素粗品的纯度在8％～13％。此外，本发明所述的恩拉霉素粗品也可以采用现有技术公开的多种以微生物进行发酵后的固体部分；本发明对于进行恩拉霉素生产发酵的菌株的具体种类没有特别的限制，可以是本领域已知或未知的任何能够进行恩拉霉素发酵生产的菌株。优选的实施方式中，固体部分是利用放线菌streptomycesfungicidious在恩拉霉素发酵培养基中发酵所获得的发酵产物，通常恩拉霉素粗品的纯度在8％～13％。本发明所述恩拉霉素生产发酵后的固体部分是通过对恩拉霉素生产发酵后获得的发酵产物进行固液分离所获得的。本发明中对于进行固液分离的方法没有特别的限制，只要能够比较充分的排除发酵产物中的水分即可，可以采用本领域常规的对发酵产物进行固液分离的方式，例如可以采用静置、离心、板框过滤的方式。优选的，通过板框过滤的方式挤压排出水分，获得湿的滤饼后进行闪蒸干燥。得到干燥粗品，水分含量约为5％～8％。将干燥粗品通过粉碎机粉碎，最终得到恩拉霉素粗品粉末(恩拉霉素的纯度为8％～13％)，即所述恩拉霉素生产发酵后的固体部分。本发明所提供的方法可以克服现有的恩拉霉素提取工艺中存在的工艺过程繁杂、生产周期长、生产过程污染排放多的缺陷，提高生产过程的效率，降低资源浪费和环境污染，获得纯度不低于70.0％的恩拉霉素产品，优选地，纯度不低于80.0％；进一步优选地，纯度不低于90.0％；最优选地，纯度不低于97.0％。本发明还提供了一种由本发明所述的提纯方法在制备饲料添加剂中的用途。下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例中，所述恩拉霉素粗品粉末优选(并不局限于此)采用如下恩拉霉素生产发酵的方法得到：1、斜面培养：将杀真菌素链霉菌bjx002(分类命名：杀真菌素链霉菌streptomycesfungicidious，保藏编号为cgmccno.6026，于2012年04月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)接种到斜面培养基上，在28℃、环境相对湿度为50-60％条件下培养10-12天。2、种子培养挖取步骤1中得到的斜面菌苔1cm2，将其接入装有30ml灭过菌的种子培养基的种子瓶，在如下条件下培养24小时：温度为28℃、环境相对湿度为50-60％、转速为180-200rpm、旋转半径为50mm，得到一级种子培养液。将一级种子培养液按10％(v/v)的接种量接种于二级种子罐，在如下条件下培养48小时：温度为28℃、环境相对湿度为50-60％、转速为180-200rpm、旋转半径为50mm，得到二级种子培养液。3、发酵培养发酵培养方法：取上述二级种子培养液按10％(v/v)的接种量接种于装有30ml灭过菌的发酵培养基的三角瓶中，在如下条件下发酵培养240小时：温度为28℃、湿度为60％、转速为190rpm、旋转半径为50mm，得到发酵液，放罐发酵液中恩拉霉素单位10000u/ml。4、发酵完成后，通过板框过滤，充分挤压排出水分，获得湿的滤饼后进行闪蒸干燥，进风温度180℃，出风温度60～70℃。得到干燥粗品，水分含量为5％～8％。将干燥后的粗品通过筛分，最终得到恩拉霉素粗品粉末(恩拉霉素纯度为8％-13％)，即恩拉霉素发酵生产后的固体部分。实施例1本实施例提供了一种恩拉霉素的提纯方法，具体操作如下：取50g恩拉霉素粗品粉末，使用丙酮水混合浸提剂(丙酮和水的体积比为1：1)800ml混合体系，调体系ph为2-4。将浸提悬浊液放入超声仪中超声1h，取出后放入40℃恒温水浴中浸提1h，转入振荡器150rpm震荡2h。震荡结束后过滤，得到滤液，转入蒸馏烧瓶中，40-80℃水浴减压蒸馏，得到恩拉霉素粗提物。将蒸馏后恩拉霉素粗提物静置2-4h，4000rpm离心5min得到固体粗提物沉淀。向离心管中加入纯净水50ml，充分震荡清洗，4000rpm离心5min，然后倒去上清液，再次用纯净水清洗，直至离心后上清液无颜色为止，得到恩拉霉素精制物。此外，本实施例还提供了如下恩拉霉素粗制物的纯度检测方法(同样可应用于其他实施例及对比例)：将恩拉霉素精制物放入50℃的恒温箱中干燥4h，放入干燥器中恒重，将干燥物碾碎成粉，转入干燥的棕色瓶中，存放于-18℃封口待检；称取大约0.1g精制物放入50ml棕色容量瓶中，向棕色容量瓶中加入40ml丙酮提取液，轻轻摇晃，放入超声仪中超声40min，使精制物充分溶解、混匀；混匀后，用提取液定容至50ml；取4ml左右溶液进行微孔滤器过滤，将滤液滤入棕色进样瓶中；清洗进样针，抽取溶液清洗2-3次，最后抽取20μl样液，并确保无气泡。打开进样口进样，然后关闭进样口，开始检测(检测波长267nm、流速1ml/min、柱温35℃、流动相＝乙腈：0.05mol/l磷酸二氢钠溶液＝27.5:72)通过所得的样品及标样的峰面积、称样量、稀释倍数计算出精制品的含量。经液相检测恩拉霉素精提物的纯度为97.6％，收率为95.6％。实施例2采用与实施例1相同的方法对恩拉霉素粗品粉末进行提纯，区别仅在于，将酸性丙酮水溶液换成等量的含有其他有机溶剂的酸性水溶液(有机溶剂和水的体积比均为1：1)，与用酸性丙酮水溶液浸提结果对比如下：有机溶剂甲醇乙醇丙酮苯氯仿纯度74.9％62.1％97.6％//实施例3采用与实施例1相同的方法对恩拉霉素粗品粉末进行提纯，区别仅在于，调节丙酮水溶液ph的酸换成硫酸、甲酸、磷酸，与用盐酸调节丙酮水溶液ph的结果对比如下：酸盐酸硫酸磷酸甲酸纯度97.6％93.3％92.4％90.1％实施例4分别取浙江海正药业股份有限公司和山东胜利生物工程有限公司的8％样品50g，采用与实施例1相同的方法对样品进行提纯，与本公司产品提纯结果对比如下：生产厂家牡丹江佰佳信浙江海正山东胜利纯度97.6％97.9％96.2％对比例1采用与实施例1相同的方法对恩拉霉素粗品粉末进行提纯，区别仅在于，改变体系ph和浸提时间。具体结果如下：对比例2采用与实施例1相同的方法对恩拉霉素粗品粉末进行提纯，区别仅在于，改变丙酮与水的体积比及浸提剂的用量。具体结果如下：体积比0.50.511156用量80012002508001200800800纯度93.1％92.9％96.7％97.4％96.4％90.2％83.5％收率87.3％88.0％79.0％96.8％97.7％70.9％54.9％虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12