可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽及组装构建高度有序纳米纤维的方法与流程

本发明涉及生物材料技术领域，且特别涉及一种可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽及组装构建高度有序纳米纤维的方法。

背景技术：

在纳米技术中，构建高度有序纳米结构有着广泛的应用价值。近年来研究表明，高度有序纳米结构在生物领域具有特殊的生物功能。蒋兴宇课题组在2008年就指出：干细胞按照一定的几何方向分化可以形成神经元、肌肉细胞、血管内皮细胞等功能性细胞，这些功能性细胞在组织内的排布具有方向性，因此功能性细胞按照一定方向生长可以形成特定的组织。当细胞培养基底的化学结构和力学性质具有方向性时，功能性细胞的生长方向具有选择性，因此通过培养基底的设计来控制功能性细胞按照一定的方向生长是组织工程研究的一个重要课题。chungcy课题组在2007年和stupp课题组在2010年相续报道：在大脑、心脏、骨骼以及脊髓等重要器官中也能发现大量的高度有序排列的细胞外纤丝，它们对各自功能的发挥起到了重要作用，但是它们的形成过程仍是一个谜。为了有效诠释有序结构的特有生物作用，如何构建具有生物相容性的有序纳米结构成了首要问题。

目前己研究和发展出多种构建有序纳米阵列的技方法，其中包括聚合物的静电纺丝技术以及真空沉淀技术等。聚合物的静电纺丝技术是将聚合物溶液或熔体在静电作用下进行喷射拉伸而获得微纳米级纤维的纺丝方法，这种方法的反应条件苛刻，需要高温高压。而真空沉积技术是利用热蒸发或辉光放电、弧光放电等物理过程，在基材表面沉积所需涂层的技术，这种技术需要高压，且产物的生物相容性较差，不利于生物方向的应用。

因此，需要构建反应条件简单、温和，具有良好生物相容性的有序纤维。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽及其制备方法，反应条件简单、温和，得到的小分子肽具有两亲性，可组装成具有良好生物相容性的高度有序纳米纤维。

本发明的目的在于提供一种高度有序纳米纤维及其组装方法，反应条件简单、温和，得到的高度有序纳米纤维具有良好生物相容性。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽，小分子肽序列依次由疏水烷基链、β-折叠氨基酸、亲水性氨基酸和n-端氨基封端构成。

进一步地，在本发明较佳实施例中，疏水烷基链包括硬脂酸、软脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸中的一种。

进一步地，在本发明较佳实施例中，β-折叠氨基酸为具有β-折叠的疏水氨基酸，具体包括丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸中的一种或几种。

进一步地，在本发明较佳实施例中，亲水性氨基酸包括谷氨酸、赖氨酸中的一种或几种。

进一步地，在本发明较佳实施例中，小分子肽的结构式为c15h31co-aaaaakk-conh2或c15h31co-vvvvkkk-conh2，其中，a为丙氨酸，v为缬氨酸，k为赖氨酸。

本发明提出一种上述的可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽的制备方法，是釆用fmoc保护策略的多肽固相合成法合成，载体树脂为rinkamide-amresin树脂，将小分子肽链段在载体树脂上从c端到n端依次延长。

进一步地，在本发明较佳实施例中，其包括以下步骤：

s1、将rinkamide-amresin树脂置于多肽固相合成柱中，用n,n-二甲基甲酰胺洗涤，排空溶剂，再用n,n-二甲基甲酰胺溶胀，排空溶剂；

s2、向固相合成柱中加入哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液，搅拌，用n,n-二甲基甲酰胺洗涤，排空溶剂；

s3、向固相合成柱中加入β-折叠氨基酸、苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑和n,n-二异丙基乙胺/n,n-二甲基甲酰胺溶液，搅拌；

s4、取样检查β-折叠氨基酸是否已接在树脂上；

s5、若β-折叠氨基酸已接在树脂上，重复步骤s2-s4，直到在树脂上接完相应的β-折叠氨基酸及数量；

s6、向固相合成柱中加入哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液，搅拌，用n,n-二甲基甲酰胺洗涤，排空溶剂；

s7、向固相合成柱中加入亲水性氨基酸、苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑和n,n-二异丙基乙胺/n,n-二甲基甲酰胺溶液，搅拌1.5-4h；

s8、取样检查亲水性氨基酸是否已接在树脂上；

s9、若亲水性氨基酸已接在树脂上，重复上述s6-s8，直到在树脂上接完相应的亲水性氨基酸及数量；

s10、向固相合成柱中加入疏水烷基链、苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑和n,n-二异丙基乙胺/n,n-二甲基甲酰胺溶液，搅拌；

s11、取样检查疏水烷基链是否已接在树脂上；

s12、若疏水烷基链已接在树脂上，分别用n,n-二甲基甲酰胺、甲醇和二氯甲烷洗涤树脂，常温真空干燥后，获得干燥树脂；

s13、向干燥树脂中加入三氟乙酸/水/三异丙基硅烷混合液体，常温搅拌，收集切落液，旋蒸浓缩至粘稠液体，然后逐滴加入到冷乙醚中沉淀，离心后去除上清液，常温干燥。

进一步地，在本发明较佳实施例中，检查基团是否已接在树脂上的方法是：取树脂，放入到茚三酮的甲醇溶液中加热沸腾3-5分钟验色，若不变色，则表明基团已接在树脂上。

本发明提出一种高度有序纳米纤维的组装方法，其是将上述的小分子肽溶解于水中至浓度为0.05wt％-12wt％，将水溶液的ph调至7-8，室温放置。

本发明提出一种高度有序纳米纤维，其是采用上述的高度有序纳米纤维的组装方法得到。

本发明实施例的可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽及组装构建高度有序纳米纤维的方法的有益效果是：本发明实施例的可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽序列依次由疏水烷基链、β-折叠氨基酸、亲水性氨基酸和n-端氨基封端构成；制备方法是釆用fmoc保护策略的多肽固相合成法合成，载体树脂为rinkamide-amresin树脂，将小分子肽链段在载体树脂上从c端到n端依次延长，反应条件简单、温和，得到的小分子肽具有两亲性，可组装成具有良好生物相容性的高度有序纳米纤维。本发明实施例的高度有序纳米纤维的组装方法是将上述的小分子肽溶解于水中至浓度为0.05wt％-12wt％，将水溶液的ph调至7-8，室温放置，反应条件简单、温和，得到的高度有序纳米纤维具有良好生物相容性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的小分子肽的结构图；

图2为本发明实施例1提供的小分子肽的质谱图；

图3为本发明实施例2提供的高度有序纳米纤维的sem图；

图4为本发明实施例3提供的高度有序纳米纤维的偏光显微镜图；

图5为本发明实施例4提供的小分子肽的结构图；

图6为本发明实施例4提供的小分子肽的质谱图；

图7为本发明实施例5提供的高度有序纳米纤维的sem图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽及组装构建高度有序纳米纤维的方法进行具体说明。

本发明实施例提供一种可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽，同时水溶性好，生物相容性优良。小分子肽序列依次由疏水烷基链、β-折叠氨基酸、亲水性氨基酸和n-端氨基封端构成，其序列通式为疏水烷基链+β-折叠氨基酸+亲水性氨基酸-conh2。其中，疏水烷基链包括硬脂酸(c18)、软脂酸(c16)、肉豆蔻酸(c14)、月桂酸(c12)中的一种，疏水烷基链的结构通式为β-折叠氨基酸为具有β折叠的疏水氨基酸，具体包括丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、甘氨酸(g)、苯丙氨酸(f)中的一种或几种；亲水性氨基酸包括谷氨酸(e)、赖氨酸(k)中的一种或几种。

本实施例中，小分子肽的结构式可以为c15h31co-aaaaakk-conh2或c15h31co-vvvvkkk-conh2，其中，a为丙氨酸，v为缬氨酸，k为赖氨酸。

本发明实施例提供一种上述的可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽的制备方法是釆用fmoc保护策略的多肽固相合成法合成，载体树脂为rinkamide-amresin树脂(树脂取代度0.6-0.65mmol/g)，将小分子肽链段在载体树脂上从c端到n端依次延长，具体合成步骤如下：

s1、将称取0.5-1.5g的rinkamide-amresin树脂置于多肽固相合成柱中，用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤至少三次，排空溶剂，再用15-40ml的n,n-二甲基甲酰胺溶胀0.5-2h后，排空溶剂。

s2、脱除rinkamide-amresin树脂中α-氨基保护的fmoc基团，具体是向固相合成柱中加入体积比为15％-40％：60％-85％的哌啶(piperiding)/n,n-二甲基甲酰胺溶液，搅拌20-60min后，用n,n-二甲基甲酰胺洗涤至少三次，排空溶剂。

s3、向固相合成柱中加入2-4倍摩尔当量的β-折叠氨基酸(例如fmoc-ala-oh、fmoc-lys(boc)-oh)、苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲氟磷酸盐(hbtu)、1-羟基苯并三氮唑(hobt)和体积比为5％-20％：80％-95％的n,n-二异丙基乙胺(diea)/n,n-二甲基甲酰胺溶液，缓慢搅拌1.5-4h。

s4、取样检查β-折叠氨基酸是否已接在树脂上，具体是取少量树脂，放入到茚三酮的甲醇溶液(0.01mg/ml)中加热沸腾3-5分钟验色，若不变色，则表明β-折叠氨基酸已接在树脂上；

s5、若β-折叠氨基酸已接在树脂上，重复步骤s2-s4，直到在树脂上接完相应的β-折叠氨基酸及数量；

s6、脱除rinkamide-amresin树脂中α-氨基保护的fmoc基团，具体是向固相合成柱中加入体积比为15％-40％：60％-85％的哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液，搅拌20-60min后，用n,n-二甲基甲酰胺洗涤至少三次，排空溶剂；

s7、向固相合成柱中加入1.5-4倍摩尔当量的亲水性氨基酸、hbtu，2-3倍摩尔当量的hobt和体积比为5％-20％：80％-95％的n,n-二异丙基乙胺/n,n-二甲基甲酰胺溶液，搅拌1.5-4h；

s8、取样检查亲水性氨基酸是否已接在树脂上，具体是取少量树脂，放入到茚三酮的甲醇溶液(0.01mg/ml)中加热沸腾3-5分钟验色，若不变色，则表明亲水性基团已接在树脂上；

s9、若亲水性氨基酸已接在树脂上，重复上述s6-s8，直到在树脂上接完相应的亲水性氨基酸及数量；

s10、向固相合成柱中加入2.5-4倍摩尔当量的疏水烷基链、hbtu、hobt和diea/dmf溶液，搅拌；

s11、取样检查疏水烷基链是否已接在树脂上，具体是取少量树脂，放入到茚三酮的甲醇溶液(0.01mg/ml)中加热沸腾3-5分钟验色，若不变色，则表明疏水烷基链已接在树脂上；

s12、若疏水烷基链已接在树脂上，分别用n,n-二甲基甲酰胺、甲醇和二氯甲烷(dcm)洗涤树脂，常温真空干燥后，获得干燥树脂；

s13、切落多肽，具体是向固相合成柱中的干燥树脂中加入体积比为94％-96％：2％-3％：2％-3％的三氟乙酸(tfa)/h2o/三异丙基硅烷(tis)混合液体，常温搅拌1.5-4h，收集切落液，旋蒸浓缩至粘稠液体，然后逐滴加入到冷乙醚中沉淀，离心后去除上清液，常温干燥12h以上，得到小分子肽。

本发明实施例提供一种高度有序纳米纤维的组装方法，其包括以下步骤：

将可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽溶解于水中，形成浓度为0.05wt％-12wt％的水溶液；

将水溶液的ph调至7-8，得组装体；

将组装体室温放置一段时间，得到高度有序纳米纤维。

在上述过程中，可以将上述的小分子肽溶解于水中，形成浓度为0.05wt％-0.1wt％(低浓度)的水溶液，再将水溶液的ph调至7-8，得组装体，最后得到高度有序纳米纤维。还可以将上述的小分子肽溶解于水中，形成浓度为7wt％-12wt％(高浓度)的水溶液，再将水溶液的ph调至7-8，于70℃-90℃加热1-2h，得组装体，最后得到平行排列的高度有序纳米纤维。

本发明实施例提供一种高度有序纳米纤维，其是采用上述的高度有序纳米纤维的组装方法得到。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

以下实施例中各原料来源途径：rinkamide-amresin树脂(树脂取代度0.625mmol/g)、α-氨基酸被9-芴甲氧羰基保护的丙氨酸(fmoc-ala-oh)、α-氨基以及侧基的氨基分别被9-芴甲氧羰基和叔丁基羰基保护的赖氨酸(fmoc-lys(boc)-oh)、苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲氟磷酸盐(hbtu)和1-羟基苯并三氮唑(hobt)均购买于吉尔生化(上海)有限公司。

软脂酸、哌啶(piperiding)、茚三酮、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、甲醇、二氯甲烷(dcm)均购买于国药集团。

三氟乙酸(tfa)、n,n-二异丙基乙胺(diea)均购买于阿拉丁(aladdin)。

三异丙基硅烷(tis)购买于萨恩化学技术(上海)有限公司。

实施例1

本实施例提供一种小分子肽，结构式为c15h31co-aaaaakk-conh2，具体合成步骤如下：

1)称取1g树脂置于多肽固相合成柱中，用dmf洗涤三次，排空溶剂，然后用20ml的dmf溶胀1h后排空溶剂。

2)脱除rinkamide-amresin树脂中α-氨基保护的fmoc基团。向固相合成柱中加入20％piperiding/dmf(v/v)，搅拌30min后，用dmf洗涤三次，排空溶剂。

3)向合成柱中加入3倍摩尔当量的fmoc-lys(boc)-oh，hbtu,hobt和2mldiea的dmf溶液20ml，缓慢搅拌2h。

4)取3)中少量树脂，放入到茚三酮的甲醇溶液(0.01mg/ml)中加热沸腾3-5分钟验色，若不变色，则表明氨基酸已接在树脂上。

5)重复上述2)、3)、4)步骤，直到接完相应的氨基酸数量。

6)脱除fmoc-ala-oh中α-氨基保护的fmoc基团。向固相合成柱中加入20％piperiding/dmf(v/v)，搅拌30min后，用dmf洗涤三次，排空溶剂。

7)向合成柱中加入2倍摩尔当量的fmoc-lys(boc)-oh，2.4倍摩尔当量的hbtu,hobt和2mldiea的dmf溶液20ml，缓慢搅拌2h。

8)取7)中少量树脂，放入到茚三酮的甲醇溶液(0.01mg/ml)中加热沸腾3-5分钟验色，若不变色，则表明氨基酸已接在树脂上。

9)重复上述6)、7)、8)步骤，直到接完相应的氨基酸数量.

10)向合成柱中加入3倍摩尔当量的软脂酸，hbtu,hobt和2mldiea的dmf溶液20ml，缓慢搅拌8h。

11)取10)中少量树脂，放入到茚三酮的甲醇溶液(0.01mg/ml)中加热沸腾3-5分钟验色，若不变色，则表明软脂酸已接在树脂上。

12)分别用dmf，甲醇和dcm洗涤树脂，常温真空干燥后，获的干燥树脂待用。

13)切落多肽。向12)获得的干燥树脂合成柱中加入30ml的tfa/h2o/tis(v/v/v＝95％/2.5％/2.5％)的混合液体，常温搅拌2h，收集切落液旋蒸浓缩至粘稠液体，然后将其逐滴加入到冷乙醚中沉淀，离心后去除上清液，常温干燥12h，得小分子肽。

对本实施例所得的小分子肽进行检测，图1为本实施例所得的小分子肽的结构图；图2为本实施例所得的小分子肽的质谱图。结果表明：小分子肽的实际分子量与理论分子量相符，小分子肽为c15h31co-aaaaakk-conh2。

实施例2

本实施例提供一种高度有序纳米纤维，其是按照以下方法制得：

将实施例1制得的小分子肽c15h31co-aaaaakk-conh2溶解于水中至浓度为0.1wt％，得水溶液。

将水溶液ph调至7.4，得组装体。

将组装体在室温放置一段时间，得到高度有序纳米纤维。

对本实施例所得的高度有序纳米纤维进行检测，图3为本实施例所得的高度有序纳米纤维的sem图。结果表明：小分子肽c15h31co-aaaaakk-conh2确实可以组装成高度有序的纳米纤维。

实施例3

本实施例提供一种具有取向的纳米纤维，其是按照以下方法制得：

将实施例1制得的小分子肽c15h31co-aaaaakk-conh2溶解于水中至浓度为10wt％，得水溶液。

将水溶液ph调至7.4，70℃-90℃加热1-2h得组装体。

将组装体在室温放置一段时间，得到具有取向的纳米纤维。

对本实施例所得具有取向的纳米纤维进行检测，图4为本实施例所得的高度有序纳米纤维的偏光显微镜图。结果表明：小分子肽c15h31co-aaaaakk-conh2确实可以组装成具有取向的纳米纤维，并且从侧面说明了小分子肽c15h31co-aaaaakk-conh2组装成的纳米纤维具有平行排列的性质。

实施例4

本实施例提供一种小分子肽，结构式为c15h31co-vvvvkkk-conh2，具体合成步骤如下：

1)称取1g树脂置于多肽固相合成柱中，用dmf洗涤三次，排空溶剂，然后用20ml的dmf溶胀1h后排空溶剂。

2)脱除rinkamide-amresin树脂中α-氨基保护的fmoc基团，向固相合成柱中加入20％piperiding/dmf(v/v)，搅拌30min后，用dmf洗涤三次，排空溶剂。

3)向合成柱中加入3倍摩尔当量的fmoc-lys(boc)-oh，hbtu、hobt和2mldiea的dmf溶液20ml，缓慢搅拌2h。

4)取3)中少量树脂，放入到茚三酮的甲醇溶液(0.01mg/ml)中加热沸腾3-5分钟验色，若不变色，则表明氨基酸已接在树脂上。

5)重复上述2)、3)、4)步骤，直到接完相应的氨基酸数量。

6)脱除fmoc-val-oh中α-氨基保护的fmoc基团。向固相合成柱中加入20％piperiding/dmf(v/v)，搅拌30min后，用dmf洗涤三次，排空溶剂。

7)向合成柱中加入2倍摩尔当量的fmoc-lys(boc)-oh，2.4倍摩尔当量的hbtu、hobt和2mldiea的dmf溶液20ml，缓慢搅拌2h。

8)取7)中少量树脂，放入到茚三酮的甲醇溶液(0.01mg/ml)中加热沸腾3-5分钟验色，若不变色，则表明氨基酸已接在树脂上。

9)重复上述6)、7)、8)步骤，直到接完相应的氨基酸数量.

10)向合成柱中加入3倍摩尔当量的软脂酸，hbtu、hobt和2mldiea的dmf溶液20ml，缓慢搅拌8h。

11)取10)中少量树脂，放入到茚三酮的甲醇溶液(0.01mg/ml)中加热沸腾3-5分钟验色，若不变色，则表明软脂酸已接在树脂上。

12)分别用dmf、甲醇和dcm洗涤树脂，常温真空干燥后，获的干燥树脂待用。

13)切落多肽，向12)获得的干燥树脂合成柱中加入30ml的tfa/h2o/tis(v/v/v＝95％/2.5％/2.5％)的混合液体，常温搅拌2h，收集切落液旋蒸浓缩至粘稠液体，然后将其逐滴加入到冷乙醚中沉淀，离心后去除上清液，常温干燥12h，得小分子肽。

对本实施例所得的小分子肽进行检测，图5为本实施例所得的小分子肽的结构图；图6为本实施例所得的小分子肽的质谱图。结果表明：小分子肽的实际分子量与理论分子量相符，小分子肽为c15h31co-vvvvkkk-conh2。

实施例5

本实施例提供一种高度有序纳米纤维，其是按照以下方法制得：

将实施例3制得的小分子肽c15h31co-vvvvkkk-conh2溶解于水中至浓度为0.1wt％，得水溶液。

将水溶液ph调至7.4，得组装体。

将组装体在室温放置一段时间，得到高度有序纳米纤维。

对本实施例所得的高度有序纳米纤维进行检测，图7为本实施例所得的高度有序纳米纤维的sem图。结果表明：小分子肽c15h31co-aaaaakk-conh2确实可以组装成高度有序的纳米纤维。

综上所述，本发明实施例的可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽及其制备方法，反应条件简单、温和，得到的小分子肽具有两亲性，可组装成具有良好生物相容性的高度有序纳米纤维。本发明实施例的高度有序纳米纤维及其组装方法，反应条件简单、温和，得到的高度有序纳米纤维具有良好生物相容性。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。